家蠶BmNAT基因的克隆、表達分析及乙?；芯?pdf

1、N-乙?；D(zhuǎn)移酶（N-acetyltransferase, NAT，EC2.3.1.5）是一種催化乙?；鶊F在乙酰輔酶A和胺之間轉(zhuǎn)移的酶。昆蟲NAT主要與色素沉積、生理節(jié)律、幾丁質(zhì)的合成、殺蟲藥物的設(shè)計等有關(guān)。家蠶（Bombyx mori）是繼果蠅之后又一典型的鱗翅目模式生物，還能作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)一些重要的藥用重組蛋白。目前對家蠶N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Bombyx mori NAT, BmNAT）的研究還比較少，關(guān)于BmNAT基因在家蠶中

2、的基因調(diào)控機制還沒有相關(guān)報導(dǎo)。
　　我們根據(jù)已公布的家蠶N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因（Bombyx mori NAT, BmNAT）序列進行了生物信息學(xué)分析，該基因序列全長1690 bp，ORF為1065 bp，編碼355個氨基酸殘基，分子量大小為39.894kDa（GenBank登錄號：XP_004932777.1），等電點pI為5.609；多序列比對的同源性分析表明，BmNAT與同是家蠶微管組織的其他BmNAT蛋白同源性較高，而與其他

3、昆蟲或者高等動物的NAT同源性較低，與BmNAT（GenBank登錄號：XP_004932776.1）的同源性最高；與玉帶鳳蝶（Papilio polytes）同源蛋白同源性最低。通過構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET28a-BmNAT，在大腸桿菌中表達融合蛋白，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在43 kDa左右有一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期大?。ㄈ诤蠘?biāo)簽3.56 kDa，BmNAT39.894 kD

4、a）相符。經(jīng)純化蛋白并免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，間接ELISA測定抗體效價達到1：12800以上，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)抗體特異性較高。分別提取家蠶各發(fā)育時期和五齡幼蟲各組織的總RNA和總蛋白，qRT-PCR和Western blotting檢測BmNAT在家蠶各時期和各組織的表達情況，分析BmNAT的表達譜。結(jié)果表明，BmNAT在家蠶頭部、蛾期、卵期的表達量較高，初步推斷BmNAT可能在這些組織或時期中發(fā)揮一定的功

5、能。亞細胞定位顯示BmNAT主要存在于細胞質(zhì)和細胞核中。通過構(gòu)建重組真核表達載體pIEx-1-BmNAT，轉(zhuǎn)染進入BmN細胞，過表達BmNAT蛋白，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示BmNAT對細胞周期可能存在一定的影響。前期研究表明，BmNAT存在乙?；揎?，我們通過定點突變、免疫沉淀和Western blotting檢測，進一步證實了BmNAT的乙?；捌湫揎椢稽c。本研究首次證實家蠶乙?；副旧淼囊阴；揎?，為認識家蠶新的基因翻譯后修飾調(diào)控機理