乙?；閷?dǎo)的家蠶Bm30K-3蛋白穩(wěn)定性機(jī)制及抗凋亡功能分析.pdf

1、蛋白質(zhì)乙?；揎検堑鞍踪|(zhì)上的賴氨酸殘基在乙酰基轉(zhuǎn)移酶的催化下，添加一個(gè)乙酰基的共價(jià)修飾過程，是一種保守的蛋白質(zhì)翻譯后修飾機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白的乙酰化/去乙?；c腫瘤的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系。而隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，非組蛋白的乙酰化修飾已經(jīng)越來越被人們所重視。研究乙酰化修飾對非組蛋白的影響已經(jīng)成為乙?；芯康闹髁?。大量研究表明，乙酰化修飾能夠競爭蛋白的賴氨酸泛素化位點(diǎn)，抑制泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑，從而提高蛋白的穩(wěn)定性，增加蛋白的細(xì)胞含量。

2、本課題前期研究通過乙酰化肽段富集技術(shù)和nano-HPLC/MS/MS鑒定了家蠶總蛋白的乙?；稽c(diǎn)。從鑒定數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)Bm30K-3蛋白存在多個(gè)乙酰化位點(diǎn)。本課題主要開展乙酰化修飾對Bm30K-3蛋白穩(wěn)定性的影響及其可能的分子機(jī)制研究。
　　首先，利用PCR的方法從家蠶cDNA文庫中擴(kuò)增了Bm30K-3基因，將其克隆至pIEX-1多克隆位點(diǎn)后經(jīng)Sca Ⅰ單酶切再與pFastBacHT B單酶切回收產(chǎn)物連接獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFas

3、tBacHT B-ie1-Bm30K-3，通過Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建獲得由極早期啟動(dòng)子ie1驅(qū)動(dòng)表達(dá)的重組家蠶桿狀病毒ie1-bacmid-Bm30K-3。Western Blotting結(jié)果分析表明，與His融合的目的蛋白His-Bm30K-3獲得成功表達(dá)。
　　隨后，我們分別使用去乙?；敢种苿㏕SA和乙?；敢种苿〤646上調(diào)及下調(diào)重組病毒ie1-bacmid-Bm30K-3感染BmN細(xì)胞的乙?；剑芯恳阴；阶?/p>

4、化對細(xì)胞內(nèi)Bm30K-3蛋白含量的影響，結(jié)果表明：乙酰化水平上調(diào)后Bm30K-3蛋白含量上升，且隨著乙酰化水平下調(diào)Bm30K-3蛋白含量也下降，表明乙酰化可以上調(diào)Bm30K-3蛋白的細(xì)胞含量。為了進(jìn)一步分析乙酰化對Bm30K-3含量變化影響的分子機(jī)制，我們使用蛋白質(zhì)合成抑制劑Cycloheximide（CHX）和蛋白酶體抑制劑MG132進(jìn)一步處理TSA處理過的BmN細(xì)胞，通過對Bm30K-3降解曲線和累積曲線的分析，我們推測乙酰化通過影

5、響蛋白的泛素化水平來調(diào)控蛋白含量的變化。隨后，我們采用His抗體免疫沉淀獲得正常感染細(xì)胞與上下調(diào)乙酰化水平感染細(xì)胞中的Bm30K-3蛋白，經(jīng)Western Blotting檢測Bm30K-3乙酰化及泛素化水平，表明TSA處理后乙酰化的上調(diào)伴隨著蛋白泛素化水平的下調(diào)，即二者存在互作關(guān)系，進(jìn)一步證明了上一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。綜合上述結(jié)果表明，Bm30K-3蛋白的乙?；赡芡ㄟ^競爭蛋白的泛素化修飾，抑制泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑，從而提高蛋白的穩(wěn)定

6、性，增加蛋白的細(xì)胞含量。
　　由于30K蛋白具有抗細(xì)胞凋亡的活性，我們建立了H2O2誘導(dǎo)的家蠶BmN細(xì)胞凋亡模型，研究Bm30K-3蛋白抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用以及乙?；瘜ζ淇沟蛲龌钚缘挠绊憽TT法及Caspase-3/7檢測試劑盒檢測的結(jié)果表明，Bm30K-3蛋白可以在一定的程度上增強(qiáng)家蠶BmN細(xì)胞的活力，而且隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量的提高，BmN細(xì)胞的活性會(huì)有一定的提升，表明Bm30K-3蛋白同樣具有抗細(xì)胞凋亡的活性。隨后使用兩

7、種抑制劑TSA/C646研究Bm30K-3的乙?；綄ζ淇沟蛲瞿芰Φ挠绊?，結(jié)果顯示，乙?；缴险{(diào)后，Bm30K-3蛋白的抗凋亡能力提升，而乙?；较抡{(diào)后，其抗凋亡能力下降，而且抗凋亡活性上下調(diào)的幅度差異較顯著，表明乙酰化修飾具有提高Bm30K-3蛋白抗細(xì)胞凋亡的能力，結(jié)合前面的研究結(jié)果，推測其機(jī)制可能是由于乙?；揎椩鰪?qiáng)了Bm30K-3蛋白的穩(wěn)定性并提高蛋白的細(xì)胞含量所致。本課題首次開展了家蠶Bm30K-3蛋白的乙?；揎椆δ苎芯?/p>