CBP介導(dǎo)的組蛋白乙?；揎椩赩AD致學(xué)習(xí)記憶功能障礙中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分.孕期開始的VAD對成年仔鼠學(xué)習(xí)記憶功能及組蛋白乙?；揎椀挠绊?br>　　目的：探討從孕期開始的VAD對仔鼠成年期學(xué)習(xí)記憶功能及組蛋白乙?；揎椀挠绊懀约?RA信號通路與組蛋白乙?；揎椂叩穆?lián)系。
　　方法：建立從孕期開始VAD的大鼠模型，實時監(jiān)測VAN與VAD組仔鼠血清中VA濃度的變化；采用水迷宮行為學(xué)檢測VAN和VAD組實驗大鼠在8W齡時的學(xué)習(xí)記憶功能；用real-time PCR和western blot技術(shù)分

2、別檢測大鼠海馬區(qū)RARα的基因和蛋白表達，同時用HAT活性檢測法檢測大鼠海馬區(qū)的HAT活性，western blot技術(shù)檢測乙?；M蛋白Ac-H3、Ac-H4的蛋白表達，real-time PCR檢測學(xué)習(xí)記憶基因Zif268、cFOS、FosB的基因表達，CHIP-qPCR對Ac-H3、Ac-H4在兩組大鼠海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶基因啟動子區(qū)域的富集情況進行檢測；進而分別用real-time PCR和western blot技術(shù)檢測組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移

3、酶CBP、p300、PCAF的基因和蛋白表達情況；最后用Co-IP和激光共聚焦技術(shù)對兩組大鼠海馬區(qū)RARα和CBP蛋白之間的相互作用情況進行檢測。
　　結(jié)果：
　?。?）實時監(jiān)測VAN與VAD組仔鼠血清中視黃醇濃度的變化：可見VAD組血清 VA濃度在生后1D、3D、7D、2W、4W、8W均明顯低于 VAN對照組（p<0.001），并在8W齡進行水迷宮行為學(xué)檢測：VAN組和VAD組大鼠均有學(xué)習(xí)記憶能力（p<0.001），但從孕

4、期開始的VAD大鼠在8W齡時學(xué)習(xí)能力明顯差于VAN組（p<0.05）；
　　（2）大鼠海馬區(qū)RARα的基因和蛋白表達：VAD組RARα表達較VAN組顯著降低（p<0.01/0.001）；
　　（3）大鼠海馬區(qū)HAT活性、乙?；M蛋白表達：VAD組大鼠海馬區(qū)的 HAT活性、乙?；M蛋白表達顯著降低（p<0.05/0.001）；大鼠海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶基因表達：VAD組大鼠海馬學(xué)習(xí)記憶基因（Zif268、cFOS、FosB）表達顯著降

5、低（p<0.01/0.05）；并且富集在記憶相關(guān)基因啟動子區(qū)域的乙?；M蛋白Ac-H3、Ac-H4蛋白水平亦顯著降低（p<0.01/0.05）；
　　（4）組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（CBP、p300、PCAF）的基因和蛋白表達：VAD組CBP、p300的基因水平顯著低于VAN組（p<0.01/0.05），PCAF在兩組間無顯著差異（p=ns）；CBP蛋白水平在VAD組表達顯著低于VAN組（p<0.001），而p300、PCAF蛋白表達水平

6、在兩組間沒有顯著差異（p=ns）；
　?。?）海馬組織Co-IP和激光共聚焦檢測RARα與CBP蛋白兩者之間的相互作用：Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)RARα與CBP蛋白之間存在蛋白-蛋白相互作用，并且這種相互作用在VAD組要顯著弱于VAN組（p<0.001）；激光共聚焦實驗證實VAD組的RARα與CBP蛋白在海馬三個分區(qū)（CA1、CA3、DG）的表達均要明顯弱于VAN組，兩者之間存在共表達，并且這種共定位在VAD組也要顯著弱于VAN組（p<

7、0.001）。
　　結(jié)論：
　?。?）成功建立了從孕期開始的VAD大鼠模型，并確證了孕期開始的VAD會引起成年期大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的障礙；
　?。?）VAD時大鼠海馬區(qū)RARα的基因和蛋白表達顯著降低；
　?。?）VAD嚴重影響了大鼠海馬HAT活性、乙?；M蛋白Ac-H3、Ac-H4以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達；
　　（4）VAD時大鼠海馬區(qū)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP、p300、PCAF表達不同程度下降，其中CBP

8、表達嚴重受損，VAD時HAT活性、Ac-H3、Ac-H4表達以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因表達的下降可能與CBP表達的下降密切相關(guān)；
　　（5）VAD引起RA信號通路和組蛋白乙?；揎椀娘@著改變，大鼠海馬區(qū)RARα和CBP表達均顯著降低，二者之間存在相互作用，并且這種相互作用在VAD組也顯著低于VAN組。RARα和CBP相互作用異常可能在VAD所致學(xué)習(xí)記憶功能障礙中起重要作用。
　　第二部分.RARα介導(dǎo)的RA信號通路對學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的

9、CBP依賴性組蛋白乙?；揎椬饔玫恼{(diào)控機制
　　第一章:RARα對學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的組蛋白乙酰化修飾作用的調(diào)控機制
　　目的：研究激活或抑制RARα介導(dǎo)的RA信號通路對CBP、HAT活性、乙酰化組蛋白以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因表達的影響。
　　方法：培養(yǎng)胎鼠原代海馬神經(jīng)元，于培養(yǎng)的第六天用NSE做標記對神經(jīng)元純度進行鑒定。設(shè)定①RFP、②RFP+RA、③RA+siRARα、④RA+Ad-RARα四個組，于培養(yǎng)的第六天，分別加入相

10、應(yīng)的RA或RFP、siRARα、Ad-RARα的重組腺病毒進行干預(yù)，于培養(yǎng)的第七天采用Real-time PCR分別檢測RARα、CBP、記憶相關(guān)基因的mRNA水平；CHIP-qPCR檢測四個組神經(jīng)元中RARα在CBP啟動子上的富集情況；于培養(yǎng)的第九天檢測各組的HAT活性，CBP、Ac-H3、Ac-H4的蛋白表達。
　　結(jié)果：
　?。?）胎鼠原代海馬神經(jīng)元生長情況良好、胞體飽滿，突觸逐漸增長、形成相互連接，經(jīng)NSE免疫熒光鑒

11、定，NSE陽性率>90％，純度滿足實驗要求；
　?。?）經(jīng)RA處理后，RARα的基因和蛋白水平顯著增高，RA+siRARα腺病毒作用后的神經(jīng)元中RARα基因和蛋白表達水平顯著低于RFP+RA組，經(jīng)RA+Ad-RARα腺病毒處理后，RARα的mRNA和蛋白表達均達到最高，顯著高于RFP+RA組（p<0.001/0.01）；
　?。?）CBP基因（p<0.001/0.01/0.05）和蛋白表達、HAT活性（p<0.001/0.0

12、1/0.05）、乙?；M蛋白Ac-H3、Ac-H4表達、記憶相關(guān)基因表達在四個組的表達趨勢均同RARα的變化趨勢基本一致，即RFP+RA組的表達水平顯著高于RFP組與RA+siRARα組，而顯著低于RA+Ad-RARα腺病毒處理組；
　　（4）RARα富集在CBP啟動子區(qū)域，并且富集的水平與RARα的表達趨勢基本一致（p<0.001/0.01/0.05）。
　　結(jié)論：
　　（1）成功培養(yǎng)并鑒定了符合實驗要求的胎鼠原代海

13、馬神經(jīng)元；
　?。?）獲得了滿足實驗需求的相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)的RARα信號；
　　（3）RARα能夠調(diào)控HAT活性、乙?；M蛋白Ac-H3、Ac-H4和下游學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達；
　　（4）RARα不僅能夠招募CBP成為輔激活子，還能直接調(diào)控CBP的表達水平，參與RA信號通路調(diào)控學(xué)習(xí)記憶基因的表達。
　　第二章:RARα介導(dǎo)的RA信號通路調(diào)控學(xué)習(xí)記憶相關(guān)信號中的CBP依賴性組蛋白乙酰化修飾機制
　　目的：研

14、究CBP信號對組蛋白乙?；{(diào)控的特異性，以及其在RARα介導(dǎo)的RA信號通路調(diào)控學(xué)習(xí)記憶相關(guān)信號中的作用機制。
　　方法：培養(yǎng)胎鼠原代海馬神經(jīng)元，于培養(yǎng)的第六天，設(shè)定（1）①NC、②siCBP兩組；（2）③Ad-RARα+NC、④Ad-RARα+siCBP/C646兩組；（3）⑤RFP+NC、⑥RFP+RA+NC、⑦RFP+NC+siCBP三組。首先利用（1）中兩個組別對四種 siCBP慢病毒（GR805/GR806/GR807/G

15、R808）進行篩選和鑒定，選出具有最佳抑制效率和功能的 siCBP慢病毒，然后在（2）、（3）分組細胞中分別加入相應(yīng)的RA、腺病毒、慢病毒或抑制劑進行干預(yù)，于培養(yǎng)的第七天采用Real-time PCR分別檢測RARα、CBP、記憶相關(guān)基因的mRNA水平；于培養(yǎng)的第九天檢測各組的HAT活性，CBP、Ac-H3、Ac-H4的蛋白表達。
　　結(jié)果：
　?。?）四種siCBP慢病毒感染原代海馬神經(jīng)元后CBP mRNA和蛋白表達有不同

16、程度降低，抑制效果最佳的GR806對神經(jīng)元的HAT活性及Ac-H3、Ac-H4表達均有顯著抑制功能（p<0.001/0.01/0.05）；
　?。?）在用Ad-RARα將RA信號通路激活的基礎(chǔ)上，siCBP能夠特異性地將激活的CBP基因（p<0.01）與蛋白表達顯著抑制下來，并且神經(jīng)元中HAT活性（ p<0.05）、乙酰化組蛋白Ac-H3、Ac-H4、記憶相關(guān)基因（p<0.001/0.05）的表達亦均被顯著下調(diào)；
　?。?）

17、siCBP慢病毒作用于神經(jīng)元后，CBP的基因表達顯著降低（p<0.05），而RARα的基因表達未發(fā)生顯著改變（p=ns）；CBP的抑制劑C646并沒有使RARα的蛋白產(chǎn)生顯著下調(diào)；
　　（4）用RA直接將RA信號通路激活后，CBP基因表達能被顯著上調(diào)（p<0.05），在RA的基礎(chǔ)上siCBP作用后，上調(diào)的CBP表達又被顯著下調(diào)（p<0.05），相應(yīng)地，下游乙酰化組蛋白Ac-H3、Ac-H4表達、記憶相關(guān)基因表達（p<0.01/0.

18、05）在三個組的表達趨勢均同CBP的變化趨勢基本一致。
　　結(jié)論：
　?。?）篩選并驗證獲得了最佳抑制效率的siCBP慢病毒；
　　（2）獲得了滿足實驗需求的相應(yīng)變化的RARα、CBP信號；
　　（3）CBP能夠特異性地調(diào)節(jié)神經(jīng)元中HAT活性、乙酰化組蛋白Ac-H3、Ac-H4和下游學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達；
　　（4）RARα在CBP的上游，RA信號通路對學(xué)習(xí)記憶相關(guān)信號的調(diào)節(jié)是通過RARα介導(dǎo)的CBP依賴