家蠶芳環(huán)雙加氧酸基因BmDio的克隆和表達(dá)以及功能分析.pdf

1、水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer，HGT)，又稱基因水平轉(zhuǎn)移或基因側(cè)向轉(zhuǎn)移(lateralgene transfer，LGT)，是指在差異生物個(gè)體之間，或單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器之間所進(jìn)行的基因傳遞過(guò)程。與此相對(duì)，基因垂直轉(zhuǎn)移指生物由其祖先繼承遺傳物質(zhì)。隨著遺傳學(xué)的深入研究，研究者揭示了不同層次上的基因轉(zhuǎn)移，拓寬了基因交流的概念，闡明了基因水平轉(zhuǎn)移在生物進(jìn)化方面具有重大意義。家蠶作為重要的鱗翅目模式昆蟲(chóng)，在經(jīng)典遺

2、傳學(xué)研究上具有重要作用。人們對(duì)其水平基因轉(zhuǎn)移方面的研究還比較少，對(duì)已分析得到的水平轉(zhuǎn)移基因是否具有功能也不甚清楚。本研究選取家蠶水平轉(zhuǎn)移基因芳環(huán)雙加氧酶基因(Dioxygenase)作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行克隆、表達(dá)及酶活鑒定，經(jīng)以上研究確定該水平轉(zhuǎn)移基因是否具有活性。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、家蠶BmDio基因的克隆及序列分析雙加氧酶基因在家蠶基因組中具有兩個(gè)拷貝，CDS全長(zhǎng)分別為819bp、885bp，兩個(gè)重復(fù)基因編碼的蛋

3、白序列的相似性為62.2％。我們選取全長(zhǎng)為819bp的拷貝進(jìn)行研究，將其命名為BmDio?；诩倚Q數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，設(shè)計(jì)引物克隆了BmDio基因。結(jié)果分析表明，BmDio CDS全長(zhǎng)819bp，定位于家蠶24號(hào)染色體，無(wú)內(nèi)含子，編碼272個(gè)氨基酸。蛋白預(yù)測(cè)分子量30.8kD，等電點(diǎn)為6.23。
　　 2、家蠶BmDio基因的原核表達(dá)將BmDio基因完整的CDS序列亞克隆到pET-28(+)表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、化到大腸桿菌表達(dá)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到約32kD的重組蛋白。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，在37℃使用終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5h，最終得到大量可溶性形式表達(dá)的重組蛋白。
　　 3、家蠶BmDio基因表達(dá)情況分析利用RT-PCR技術(shù)分析BmDio基因在家蠶不同發(fā)育時(shí)期及不同組織的表達(dá)模式。結(jié)果表明，BmDio基因在整個(gè)發(fā)育期及5齡3天的各組織均高量表達(dá)。
　　 通過(guò)Ni柱親和層析方法純化原核表達(dá)的BmDio蛋白，免疫

5、小鼠制備多克隆抗體；通過(guò)Western blotting分析5齡3天家蠶Dio蛋白在各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果與mRNA水平表達(dá)譜結(jié)果大體吻合，只是在血液中蛋白近似不表達(dá)，與表達(dá)譜分析結(jié)果有差異。
　　 4、家蠶BmDio砌基因的功能初探利用Dio基因編碼蛋白參與的特異顏色反應(yīng)，我們對(duì)家蠶BmDio基因的功能進(jìn)行了初步研究。制備酶粗提液，取上清加適量底物鄰苯二酚溶液，置30℃左右溫育30分鐘用分光光度計(jì)測(cè)OD375nm值。測(cè)定結(jié)果