中華蜜蜂(Apisceranacerana)MsrA基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、蜜蜂的壽命及抗性與蜜蜂的抗氧化能力有直接聯(lián)系，生物體內(nèi)活性氧（ROS）的積累能引起DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的氧化性損傷，如甲硫氨酸被氧化而變?yōu)榧琢虬彼醽嗧?，可?dǎo)致其所在蛋白的生物學(xué)活性降低或喪失。生物體內(nèi)普遍存在的甲硫氨酸亞砜還原酶（methionine sulfoxide reductases，Msrs）可催化甲硫氨酸亞砜還原為甲硫氨酸，使其所在蛋白質(zhì)恢復(fù)活性。甲硫氨酸亞砜還原酶的這種催化還原作用，在蛋白修復(fù)及間接抗氧化方面發(fā)揮著重

2、要的作用。目前，關(guān)于Msrs的研究主要集中在生物抗氧化及壽命調(diào)節(jié)方面，在蜜蜂中的研究很少。蜜蜂做為一種授粉昆蟲，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及維持生態(tài)平衡中起重要作用。蜜蜂外出采蜜時會遭受到多種環(huán)境脅迫，為明確MsrA在蜜蜂抗氧化及發(fā)育中的作用。本研究以中華蜜蜂（Apis cerana cerana）為材料，首次從中華蜜蜂中克隆得到甲硫氨酸亞砜還原酶A（AccMsrA）基因，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）及免疫組化的方法，首次分析了AccMs

3、rA在昆蟲不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平的變化，探索了其在紫外線（30 mj/cm2）、高溫（43℃）及H2O2（2 mM）三種不同氧化刺激下的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究該基因的功能及作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、通過RT-PCR和RACE-PCR的方法從中華蜜蜂中克隆得到MsrA基因，命名為AccMsrA，其GenBank注冊號為HQ219724，cDNA全長1,540 bp，包含136 bp的5′UTR,753 bp的

4、3′UTR和651 bp的ORF，編碼一個有217個氨基酸殘基，分子量約為25 kD的蛋白。同源分析得出AccMsrA同來源于埃及斑蚊、榕果蠅、致倦庫蚊中的幾種MsrA的同源性分別為49.6％、45.8％和 51.3％。序列分析發(fā)現(xiàn)，AccMsrA具有MsrA的保守區(qū)，該保守區(qū)內(nèi)存在典型特征序列GCFW，其中的半胱氨酸殘基是其催化還原過程中的一個活性位點。cDNA序列與基因組序列比對后發(fā)現(xiàn)AccMsrA基因組序列內(nèi)存在四個內(nèi)含子，其中一

5、個內(nèi)含子位于5′UTR內(nèi)。
　　 2、通過iPCR的方法獲得了1,364 bp的AccMsrA基因啟動子序列，經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域中存在tramtrack(Ttk)、cell factor 2-II(CF2-II)、hunchback(Hb)、Broad-Complex(BR-C)四種與發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，還有五個heat shock factor(HSF)熱激響應(yīng)元件。qRT-PCR檢測到AccMsrA在五日齡幼蟲及成蟲

6、頭部具有較高表達(dá)。推測AccMsrA參與了蜜蜂的生長發(fā)育調(diào)節(jié)并在成蟲不同組織部位存在表達(dá)差異。此外，AccMsrA的轉(zhuǎn)錄水平受紫外線（30 mj/cm2）、高溫（43℃）和H2O2（2 mM）的誘導(dǎo)而提高，表明其在抵抗外界氧化刺激過程中發(fā)揮重要的作用。
　　 3、分別以pMD18-T simple和pET-30a(+)為克隆載體和表達(dá)載體構(gòu)建了AccMsrA基因編碼區(qū)的原核融合表達(dá)載體AccMrsA-pET-30a(+)，轉(zhuǎn)化大