中華蜜蜂AChE基因克隆、表達及其在農(nóng)藥殘留檢測中應用.pdf

1、食品中的農(nóng)藥殘留超標是影響食品安全的重大問題，目前用于農(nóng)藥殘留檢測工作的主要方法之一是酶抑制法，主要用來檢測蔬菜水果中的有機磷和氨基甲酰酯類農(nóng)藥殘留。
　　乙酰膽堿酯酶(Acetyl cholinesterase，AChE，EC3.1.1.7)可用于有機磷農(nóng)藥殘留的檢測，它是分布于脊椎動物膽堿神經(jīng)節(jié)和無脊椎動物神經(jīng)肌肉接頭處的重要的水解酶，能特異性催化生物體內(nèi)的乙酰膽堿進行水解反應，從而終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮，保證神經(jīng)信號在

2、生物體內(nèi)的正常傳遞。而有機磷和氨基甲酰酯類是 AChE的抑制劑，能特異性抑制 AChE的活性，使乙酰膽堿不能水解，累積于突觸間隙從而對人體造成危害。
　　中華蜜蜂（Apis cerana cerana）是我國獨有的蜜蜂當家品種，蜜蜂對農(nóng)藥的敏感性很高，經(jīng)常被作為生物指標來檢測環(huán)境中存在的農(nóng)藥污染類型，而中華蜜蜂來源的AChE基因尚未被克隆及應用于食品安全監(jiān)測。
　　本實驗以中華蜜蜂頭部組織總 RNA為模板，經(jīng)末端克?。≧AC

3、E）法獲得了AChEcDNA全序列，全長約2,455 bp，開放閱讀框長1,887bp，共編碼629氨基酸，生物信息學分析表明該片段與GenBank中查到的中華蜜蜂AChE2部分基因序列片段同源對比相似性達到99％，與意大利蜜蜂（Apis mellifera）AChE2的相似性達到了95%。
　　在得到中華蜜蜂AChE cDNA全長的基礎上，構建了一系列重組表達載體，先后在大腸桿菌及畢赤酵母中誘導表達中華蜜蜂AChE，從中篩選出一

4、株表達效果及酶活性水平較高的菌株。首先構建了pET-28a-pelB-AChE重組表達質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中使用0.1mM IPTG誘導表達，目的蛋白得到成功表達。使用畢赤酵母表達載體構建了多種重組表達載體，采用不同的酶切位點線性化質(zhì)粒，經(jīng)電轉(zhuǎn)化法將目的基因表達盒整合入畢赤酵母 GS115基因組上，在 MD平板、G418抗性篩選及PCR驗證后，經(jīng)相同條件，使用0.5%甲醇誘導表達目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、蛋白含量及酶活性

5、分析表明，含pPIC3.5K-OAC表達盒的畢赤酵母重組表達菌株的表達效果及酶活性水平均較好，該重組菌株編碼522氨基酸，預期目的蛋白大小為57 KDa，其目的基因表達盒使用SalⅠ酶切線性化后轉(zhuǎn)入GS115。實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導表達120 h時，其表達量及酶活性最高，提取酵母胞內(nèi)總蛋白，使用His-Taq純化試劑盒純化透析后，可以獲得純凈的重組中華蜜蜂AChE，其比活力可高達10,568 U/mg。與市場上現(xiàn)有銷售的農(nóng)藥殘留試劑盒中的酶