甘藍(lán)開(kāi)花調(diào)控基因FLC的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、甘藍(lán)(Brassica oleracea L.)是重要的十字花科蕓薹屬蔬菜作物，通過(guò)低溫春化可以誘導(dǎo)其開(kāi)花，甘藍(lán)屬于綠體春化類型，在生產(chǎn)上，比較容易發(fā)生“未熟抽薹”或“先期抽薹”現(xiàn)象，給生產(chǎn)造成損失;而在育種上，為了縮短育種周期，加快育種進(jìn)程獲得品質(zhì)優(yōu)良的品種，需要植株提前抽薹開(kāi)花。因此對(duì)甘藍(lán)花期調(diào)控機(jī)制的研究在栽培生產(chǎn)和品種選育上都具有非常重要的意義。FLC是一個(gè)開(kāi)花抑制基因，主要在植物莖尖和根尖分生組織表達(dá)，它編碼一個(gè)MADS-bo

2、x轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在整個(gè)花期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。對(duì)甘藍(lán)FLC基因的研究，既有利于甘藍(lán)開(kāi)花時(shí)間調(diào)控的深入研究，又可以為蕓薹屬蔬菜的花發(fā)育研究提供借鑒。
　　本實(shí)驗(yàn)以兩種結(jié)球甘藍(lán)（耐抽薹“黃苗”和易抽薹“ZQ”）為試驗(yàn)材料，利用已經(jīng)公開(kāi)的開(kāi)花調(diào)控基因的保守序列設(shè)計(jì)同源引物，克隆到了開(kāi)花抑制基因FLC，分別得到了兩種甘藍(lán)材料的5個(gè)FLC基因的cDNA序列，并利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了兩種甘藍(lán)材料中的FLC基因的特異性表達(dá)。主要研究結(jié)果如

3、下:
　　1.開(kāi)花抑制基因FLC的克隆與分析
　　利用已經(jīng)公開(kāi)的開(kāi)花時(shí)間基因的保守序列設(shè)計(jì)同源引物，從兩種甘藍(lán)材料莖尖總RNA反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA中擴(kuò)增得到了5個(gè)FLC基因，分別命名為YBoFLC-1(607bp)、YBoFLC-2(607bp)、YBoFLC-3(607bp)、YBoFLC-4(608bp)、YBoFLC-5(608bp);ZBoFLC-1(607bp)、ZBoFLC-2(607bp)、ZBoFLC-3(

4、604bp)、ZBoFLC-4(607bp)、ZBoFLC-5(604bp)，其中BoFLC-3、BoFLC-5的最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?91bp，可以編碼196個(gè)氨基酸殘基;BoFLC-1、BoFLC-2、BoFLC-4的最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?94bp，可以編碼197個(gè)氨基酸殘基。
　　采用生物信息學(xué)的方法，利用MEGA等多種軟件研究了甘藍(lán)FLC蛋白與其他物種FLC蛋白的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。還預(yù)測(cè)了甘藍(lán)FLC蛋白的結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、親

5、水性、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，甘藍(lán)BoFLC-1、BoFLC-2、BoFLC-4與白菜BrFLC3、白菜BrFLC、芥菜BjFLC-like在同一進(jìn)化枝上，親緣關(guān)系最近。其與BoFLC-3、BoFLC-5親緣關(guān)系比較近，與白芥SaFLC親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。甘藍(lán)BoFLC蛋白屬于MIKC型MADS蛋白，BoFLC-1、BoFLC-2、BoFLC-4蛋白可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)共有18個(gè)。其中，絲氨酸(Ser)15個(gè)，蘇氨酸(Thr)

6、2個(gè)，酪氨酸(Tyr)1個(gè);而B(niǎo)oFLC-3、BoFLC-5蛋白可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)共有14個(gè)。其中，絲氨酸(Ser)12個(gè)，蘇氨酸(Thr)1個(gè)，酪氨酸(Tyr)1個(gè)。甘藍(lán)BoFLC蛋白都屬于親水性蛋白，不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于胞外分泌蛋白或膜蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α螺旋和隨機(jī)卷曲為主。
　　2.兩種甘藍(lán)材料中5個(gè)FLC基因的表達(dá)分析
　　利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了在低溫處理下，兩種甘藍(lán)材料中5個(gè)FLC基因的表達(dá)情況。結(jié)

7、果顯示:兩種甘藍(lán)材料中的5個(gè)FLC基因表達(dá)趨勢(shì)基本上一致，在低溫處理第28d開(kāi)始出現(xiàn)表達(dá)量下降的趨勢(shì)，隨著春化處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸減少，在第42d表達(dá)量顯著下降，并在春化臨界期時(shí)幾乎檢測(cè)不到。其中BoFLC-3、BoFLC-5比BoFLC-1、BoFLC-2、BoFLC-4在第42d表達(dá)量下降劇烈。此外，耐抽薹甘藍(lán)“黃苗”中的FLC基因的表達(dá)量比易抽薹甘藍(lán)“ZQ”中的表達(dá)量高，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，“黃苗”中的FLC表達(dá)量下降幅度