花鱸繁殖相關(guān)基因的克隆及其在雄性個體中的表達(dá)調(diào)控分析.pdf

1、本文以山東近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的雄性花鱸(Lateolabrax maculatus)為研究對象，采用組織學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和分子生物學(xué)等方法，研究花鱸精巢發(fā)育特定時期給予激素和鹽度處理后其繁殖生理功能的變化規(guī)律及分子機(jī)制等。研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.花鱸繁殖相關(guān)基因的克隆
　　采用RACE技術(shù)，利用5'和3'特異引物獲得基因全長cDNA序列?？寺〉玫交|繁殖相關(guān)的全長基因共12個，分別為(GTHa亞基、FSHβ亞基、LHβ亞基、St

2、AR、AMH、FTZ-F1a、FTZ-F1b、CYP171、3β-HSD、vasa、cGnRH-Ⅱ和PRL)，以及非全長基因6個（CYP17-Ⅱ、FSHR、PRLR、GR、AR、SOX9）。通過Clustal W進(jìn)行多序列比對并利用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示所獲得的基因在進(jìn)化上具有高的保守性且都與鱸形目相應(yīng)物種的親緣關(guān)系最近。
　　2.花鱸繁殖相關(guān)基因的周期和空間表達(dá)
　　對花鱸繁殖相關(guān)基因(GTHs亞基、

3、StAR、AMH、FTZ-F1、CYP171、3β-HSD和AR)在繁殖周期內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所檢測基因的表達(dá)量在繁殖周期內(nèi)都發(fā)生了顯著變化，暗示了它們參與了花鱸精巢發(fā)育和繁殖過程。對于這些基因的空間表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，它們都在類固醇生成相關(guān)組織如精巢、腦、垂體、肝臟、頭腎等中表達(dá)量高，但在其他組織中也可以檢測到基因表達(dá)信息。采用原位雜交技術(shù)檢測精巢內(nèi)CYP17Ⅰ和3β-HSD基因的定位，發(fā)現(xiàn)這兩個基因都在精巢間質(zhì)區(qū)域檢測到陽性信

4、號。同時結(jié)合組織學(xué)和激素水平的研究，從而對花鱸繁殖相關(guān)基因的功能進(jìn)行更深入的探索。
　　3.雄性花鱸在激素處理后的組織學(xué)、睪酮水平及繁殖相關(guān)基因表達(dá)量的變化
　　給予雄性花鱸注射hCG/GnRHa后，發(fā)現(xiàn)精巢生殖細(xì)胞發(fā)育程度提高，血清中睪酮含量升高。外源激素對腦、垂體和精巢內(nèi)GTHs亞基基因，精巢中的StAR、FTZ-F1、CYP171、3β-HSD以及腦中的AR基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用，而對于精巢內(nèi)的AMH和AR基因的mRN

5、A表達(dá)有抑制作用。依據(jù)這些結(jié)果推測外源激素可以促進(jìn)雄性花鱸精巢細(xì)胞的發(fā)育，而且所檢測的基因都受到促足性腺激素和促性腺激素釋放激素的調(diào)控。
　　4.雄性花鱸在鹽度處理后滲透壓水平、精巢組織學(xué)、激素水平及繁殖相關(guān)基因表達(dá)量的變化
　　經(jīng)過半咸水和淡水處理1-8d后，發(fā)現(xiàn)花鱸血清滲透壓水平顯著降低，這與血清中睪酮水平(1-6d)以及精巢組織學(xué)變化情況一致。淡水組中，血清FSH和LH濃度降低，而在半咸水組和淡水組鹽度適應(yīng)的前兩天，垂