黃鱔性逆轉相關基因的克隆及其調控機制的研究.pdf

1、本研究克隆獲得了黃鱔wt1、foxl2、dax1和amh基因的全長序列，并分析了它們在黃鱔性腺不同發(fā)育時期以及不同組織間的表達差異。序列分析結果發(fā)現wt1、foxl2、dax1在不同物種間保守性較高，而amh在不同物種間保守性并不高。18s、ef1α和rpl17為黃鱔性腺發(fā)育研究中穩(wěn)定的內參基因，可以對目的基因進行矯正。半定量研究結果表明，wt1和dax1基因廣泛分布在包括性腺在內的多個組織中，說明這兩個基因的功能比較復雜。而在性腺、腦

2、和眼中能檢測到foxl2的表達，表明該基因參與了魚類眼部結構的形成和發(fā)育。amh只局限在性腺中表達，表明該基因對性腺的發(fā)育和分化具有重要作用。實時熒光定量和免疫組織化學研究結果發(fā)現，wt1基因在三種性別的性腺中都有表達，且wt1蛋白主要在精巢的支持細胞中表達以及只在卵巢的顆粒細胞中表達，表明該基因不管是對精母細胞的生長以及精子的成熟，還是對卵母細胞的生長和成熟都起到了一定的作用;在雌性卵巢顆粒細胞、間質細胞以及未成熟的卵母細胞中能檢測到

3、foxl2蛋白的分布，并且在性腺中的表達量雌性＞間性＞雄性，foxl2蛋白也分布在間性性腺和雄性性腺的精巢間質細胞中，表明卵母細胞的發(fā)育以及功能的維持需要foxl2的持續(xù)表達，且它對雌雄同體魚類的精巢功能的維持也起到重要的作用。相反，amh基因在性腺中的表達量雄性＞間性＞雌性，表明該基因的上調能夠啟動黃鱔雄性支持細胞的分化，并且對黃鱔雄性的發(fā)育和精巢的維持具有一定的作用。dax1不管是在雌性、間性和雄性都有高水平的表達，表明它與黃鱔卵巢

4、的發(fā)育以及精巢的發(fā)育和維持有關。此外，這些基因也可以通過直接或間接調控cyp19a1amRNA的表達來調控性腺的發(fā)育。
　　本研究測定了HPG軸、HPT軸和HPI軸上相關激素和基因的表達。血清激素測定結果表明，雌二醇(E2)和皮質醇激素在黃鱔性腺發(fā)育不同時期沒有明顯的變化趨勢，表明E2和皮質醇對性腺發(fā)育的影響可能還受到其受體基因的調控。但三碘甲狀腺原氨酸(T3)和游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)在雌性和雄性中表達量很高，但在間性中有

5、顯著下降，表明甲狀腺激素可能參與黃鱔的性腺發(fā)育和性逆轉過程的啟動。對促性腺激素受體基因的研究顯示，fshr和lhr基因在隨著黃鱔性腺的發(fā)育都有先升高后降低，然后再升高的變化趨勢。lhr在產卵前期（雌性V期）表達量達到高峰，而fshr在雄性時期達到高峰，結果表明LH對誘導黃鱔卵母細胞的成熟和排卵有關，且FSH和LH對調節(jié)早期精巢的發(fā)育，精子的發(fā)生以及成熟具有重要作用。star基因的表達模式與fshr類似，表明star基因與黃鱔精巢的早期分

6、化和精子的成熟有關。另外，star基因的表達和fshr基因的表達存在明顯的相關性，表明在黃鱔性腺發(fā)育過程中，star基因的表達可能受到FSH的調控。
　　在對黃鱔vtg基因的表達模式研究中發(fā)現，vtg基因主要在肝臟中表達，特別是在雌性中，說明黃鱔雌性卵母細胞發(fā)育過程需要外源性的肝臟合成的卵黃蛋白原。卵巢發(fā)育從第Ⅲ期到第Ⅳ期和Ⅴ期時，vtg基因在肝臟中的表達量顯著升高，表明肝臟中卵黃蛋白原基因表達量的升高與卵母細胞卵黃的積累和成熟相

7、關。但隨著黃鱔卵母細胞的退化和精巢組織的發(fā)育，肝臟中卵黃蛋白原基因表達量顯著下降，待進入雄性時期時基本檢測不到卵黃蛋白原的表達，表明肝臟卵黃蛋白原合成量的減少有助于卵母細胞的退化和精巢發(fā)育的激活。另外，本研究還測定了黃鱔er基因的兩個亞型，erα和e邛，以及ar和gr基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時期肝臟組織和性腺組織中的表達差異。研究表明，erα在肝臟的表達量高于erβ，表明erα比erβ在肝臟卵黃蛋白原的生成調節(jié)中具有更重要的作用。erα在

8、肝臟中的表達量隨著卵黃的積累以及卵母細胞的成熟逐漸降低，表明E2對雌性黃鱔卵黃的積累的作用可能主要是通過erα來介導的，且隨著卵母細胞的成熟，E2誘導卵黃的積累作用減弱。但隨著卵母細胞的成熟，vtg的表達量顯著性升高，說明卵黃的積累除了受到E2的誘導外還受到其它激素的干擾。在性腺中，erα的表達量隨著卵母細胞的成熟逐漸升高，說明性腺卵母細胞的成熟與排卵可能需要一定水平的E2的刺激。當性腺發(fā)育進入間性時期，肝臟erα的表達量有所升高，可能

9、是由于黃鱔卵母細胞發(fā)育不同步，進入間性時期時仍需要持續(xù)的卵黃蛋白原的供應，而性腺中erα的表達量顯著降低，表明E2對性腺作用的減退有助于卵母細胞的退化和精巢組織的發(fā)育。但雄性性腺中erα也有高水平表達，表明E2也參與了雄性性腺的發(fā)育和精巢的維持。ar的表達量在雌性和雄性黃鱔中都是隨著卵母細胞和精原細胞的發(fā)育與成熟表達量顯著升高，表明ar對黃鱔雌性性腺和雄性性腺的發(fā)育都起到了一定的作用。gr水平也是隨著性腺的發(fā)育表達量逐漸升高，特別在雄性