青蝦IAG及相關(guān)基因的克隆及調(diào)控關(guān)系的研究.pdf

1、青蝦，學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachium nipponensis)，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種。雌雄青蝦生長(zhǎng)差異顯著，商品雄蝦的平均規(guī)格為雌蝦的2～2.5倍。因此，全雄化養(yǎng)殖可以大幅度提高青蝦的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。性別控制技術(shù)是實(shí)現(xiàn)青蝦單性化養(yǎng)殖的基礎(chǔ)，而要實(shí)現(xiàn)青蝦性別的人工控制，首先要確定性別決定基因及其調(diào)控機(jī)制，但有關(guān)研究幾乎空白，制約了青蝦性別控制技術(shù)的發(fā)展。
　　促雄腺(androgenic gland，AG)是甲殼動(dòng)物性

2、別分化（雄性化）的關(guān)鍵器官，其分泌的胰島素樣促雄腺激素(insulin-like androgenic gland hormone，IAG)在甲殼動(dòng)物的性別分化中起著關(guān)鍵作用。體外研究表明，胰島素樣促雄腺激素結(jié)合蛋白(insulin-like androgenic gland hormone binding protein gene，IAGBP)能特異地結(jié)合IAG激素，然而在甲殼動(dòng)物體內(nèi)IAG與IAGBP之間是否存在相互調(diào)控關(guān)系以及如何

3、調(diào)控，迄今未見(jiàn)報(bào)道。另一方面，研究表明眼柄中的神經(jīng)激素對(duì)IAG基因起著負(fù)調(diào)控作用，但具體那種（些）神經(jīng)激素發(fā)揮作用尚不清楚。本文擬以青蝦為研究對(duì)象，以促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)為基礎(chǔ)克隆青蝦IAG和IAGBP的cDNA序列，并獲得其基因組序列，在轉(zhuǎn)錄水平上研究了上述兩個(gè)基因的相互調(diào)控關(guān)系;同時(shí)研究了神經(jīng)激素—高血糖素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)、性腺抑制激素(gonad inhibitinghorm

4、one，GIH)和蛻皮抑制激素(molt inhibiting hormone，MIH)對(duì)IAG基因的調(diào)控作用，并克隆了它們的基因組序列;研究表明，IAG基因在甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)過(guò)程中起著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的作用。因此本文在青蝦IAG基因組內(nèi)含子中進(jìn)行了與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)的篩選。
　　1.青蝦IAG和IAGBP基因的克隆及在發(fā)育過(guò)程和成體組織中的表達(dá)分

5、析
　　本文通過(guò)采用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)克隆青蝦IAG和IAGBP的cDNA序列，并獲得了其基因組序列。
　　IAG基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1653bp，其中5'非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)為222 bp，開放閱讀框?yàn)?28bp、3'UTR為903bp，3'端有一個(gè)Poly(A)尾巴，加尾信號(hào)AATAAA位于Po

6、ly(A)尾巴的前端。青蝦IAG多肽由一個(gè)信號(hào)肽（27個(gè)氨基酸）和一個(gè)前體多肽(148個(gè)氨基酸)組成。青蝦IAG前體多肽由A鏈、B鏈和C鏈構(gòu)成。其中B鏈有40個(gè)氨基酸，C鏈有65個(gè)氨基酸，A鏈有43個(gè)氨基酸。
　　青蝦IAG基因組序列存在兩個(gè)基因拷貝，這兩個(gè)基因拷貝均由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。兩者的區(qū)別在于，第4內(nèi)含子的長(zhǎng)度有所不同。具體構(gòu)成如下，IAG基因組序列Ⅰ全長(zhǎng)5579bp(GenBank: KF811212)，具體為

7、:外顯子1(27bp)、內(nèi)含子1(1795bp)、外顯子2(172bp)、內(nèi)含子2(615bp)、外顯子3(113bp)、內(nèi)含子3(1193bp)、外顯子4(183bp)、內(nèi)含子4(1448bp)、外顯子5(33bp); IAG基因組序列Ⅱ全長(zhǎng)4739bp(GenBank: KJ831646)，此序列第4內(nèi)含子為608bp，其它的內(nèi)含子和外顯子長(zhǎng)度與IAG基因組序列Ⅰ相同。分析內(nèi)含子的序列發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因組序列所有內(nèi)含子的5'端有GT堿

8、基和3'端存在AG堿基，屬于“GT-AG”型內(nèi)含子。IAG基因在檢測(cè)的組織中僅在促雄腺和肝胰腺中表達(dá)。在促雄腺中的表達(dá)量最高，在肝胰腺中也有表達(dá)，表達(dá)量約為促雄腺表達(dá)量的1％。IAG基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)結(jié)果為，在胚胎期表達(dá)最低，其次是出膜后期，表達(dá)量最高的是變態(tài)后期。具體而言，在胚胎期，從卵裂期到無(wú)節(jié)幼體期，表達(dá)量一直較低，蚤狀幼體期表達(dá)量升高;在出膜后的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定;在變態(tài)后階段最高的表達(dá)量出現(xiàn)在第10天(PL10)，且從變態(tài)后

9、第20天(PL20)到成蝦表達(dá)量呈相對(duì)穩(wěn)定上升趨勢(shì)。
　　IAGBP基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1085bp（GenBank: KJ831645），其中5'UTR為60bp，開放閱讀框?yàn)?59bp、3'UTR為266bp，3'端有一個(gè)Poly(A)尾巴。IAGBP多肽結(jié)構(gòu)域分為三部分:IB結(jié)構(gòu)域（從第26個(gè)氨基酸到第100個(gè)氨基酸）、KAZAL結(jié)構(gòu)域（從第97個(gè)氨基酸到第138個(gè)氨基酸）和IG_like（從第154個(gè)氨基酸到第233個(gè)

10、氨基酸）。青蝦IAGBP基因組序列和IAG基因組一樣也存在兩個(gè)拷貝，這兩個(gè)拷貝均由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。兩者的區(qū)別在于，第1內(nèi)含子的長(zhǎng)度上有所不同。具體構(gòu)成如下，IAGBP基因組序列Ⅰ全長(zhǎng)4055bp(GenBank: KJ831648)，具體為:外顯子1(98bp)、內(nèi)含子1(2084bp)、外顯子2(323bp)、內(nèi)含子2(625bp)、外顯子3(144bp)、內(nèi)含子3(587bp)、外顯子4(194bp);I4 GBP基因組

11、序列Ⅱ全長(zhǎng)3678bp(GenBank: KJ831647)，此序列第1內(nèi)含子為1707bp，其它的內(nèi)含子和外顯子長(zhǎng)度與IA GBP基因組序列Ⅰ相同。IAGBP基因在檢測(cè)的組織中都有表達(dá)。在精巢的表達(dá)量最高，其次是肌肉和肝胰腺，表達(dá)量最少的組織是眼柄。IAGBP基因在胚胎期表達(dá)最低，出膜后表達(dá)量逐漸升高，在變態(tài)后保持較高的表達(dá)量，在成體的表達(dá)量最高。
　　2.青蝦IAG和IAGBP基因相互調(diào)控關(guān)系的研究
　　本文采用RNA干

12、擾(RNA interference，RNAi)和熒光定量PCR(quantitativeReal-Time PCR，qRT-PCR)技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上研究了上述兩個(gè)基因的相互調(diào)控關(guān)系。
　　沉默IAGBP基因，IAGBP和IAG基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比分別下降到21.4％和43.5％(P＜0.01)。沉默IAG基因，IAG基因的表達(dá)量下降到對(duì)照組的11.6％(P＜0.01)，而在精巢、肌肉、促雄腺和肝胰腺等組織，IAGBP基因的

13、表達(dá)量分別下降到對(duì)照組的52.4％(P＜0.01)、58.4％(P＜0.01)、55.3％(P＜0.01)和59.7％(P＜0.01):在眼柄、腦、心臟和神經(jīng)索組織中，IAGBP基因的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。結(jié)果表明，青蝦IAGBP和IAG基因存在相互的正調(diào)控關(guān)系。
　　3.GIH, MIH和CHH基因?qū)AG基因調(diào)控作用的研究
　　本文采用RNAi和qRT-PCR技術(shù)，研究了GIH, MIH和CHH基因?qū)AG基因的調(diào)控作用，

14、同時(shí)運(yùn)用基因組步移技術(shù)克隆了GIH, MIH和CHH基因組序列。
　　基因組步移的結(jié)果顯示，GIH, MIH和CHH基因組序列均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。具體而言.GIH的基因組序列包括:外顯子1(36bp)、內(nèi)含子1(511bp)、外顯子2(189bp)、內(nèi)含子2(1507bp)、外顯子3(114bp); MIH的基因組序列包括:外顯子1(36bp)、內(nèi)含子1(752bp)、外顯子2(183bp)、內(nèi)含子2(649bp)、外

15、顯子3(114bp); CHH的基因組序列包括:外顯子1(18bp)、內(nèi)含子1(1524bp)、外顯子2(285bp)、內(nèi)含子2(729bp)、外顯子3(105bp)。在這三個(gè)多肽序列中GIH和MIH擁有相同的內(nèi)含子插入位點(diǎn):內(nèi)含子1插入在Gln12和Lys13(GIH)/Arg13(MIH)之間，內(nèi)含子2插入在成熟多肽的Lys41(GIH)/Arg41(MIH)和Lys42之間。而CHH的內(nèi)含子插入位點(diǎn)則與它們不同，內(nèi)含子1的插入位點(diǎn)

16、在Val6和Met7之間，內(nèi)含子2的插入位點(diǎn)在成熟多肽的Arg40和Glu41之間。本文第一次在DNA水平提供了CHH家族神經(jīng)激素基因的分類依據(jù)。
　　本文在轉(zhuǎn)錄水平研究了CHH家族神經(jīng)激素基因?qū)AG基因的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)眼柄處理組:未剪除組（對(duì)照組）、單側(cè)眼柄剪除組和雙側(cè)眼柄剪除組;3個(gè)實(shí)驗(yàn)組:分別干擾GIH，MIH和CHH基因。沉默GIH，MIH和CHH基因發(fā)現(xiàn)，GIH，MIH和CHH基因的轉(zhuǎn)錄水平分別下降到對(duì)照組的1

17、3.5％(P＜0.01)、19.4％(P＜0.01)和22.5％(P＜0.01)。本文進(jìn)一步將3個(gè)干擾組中IAG基因的表達(dá)量與對(duì)照組、單側(cè)眼柄剪除組和雙側(cè)眼柄剪除組做了對(duì)照。IAG基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比分別上升了452.7％(P＜0.01)(單側(cè)眼柄剪除組)、660.2％(P＜0.001)（GIH干擾組）、472.9％(P＜0.01)(MIH干擾組)、112.4％(P＞0.05)(CHH干擾組)、1049.1％(P＜0.001)（雙側(cè)

18、眼柄剪除組）。結(jié)果表明，GIH和MIH基因負(fù)調(diào)控IAG基因的表達(dá)。
　　4.青蝦IAG基因組序列中與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)篩選
　　本文應(yīng)用限制性酶切長(zhǎng)度片段多態(tài)性(Restriction fragment lengthpolymorphism-PCR，RFLP-PCR)技術(shù)在青蝦IAG基因的內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行了與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)篩選。結(jié)果顯示，在IAG基因組第一內(nèi)含子和第二內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)SNP位點(diǎn):509G＞T、

19、529G＞T和590A＞T位于內(nèi)含子1，2226A＞G位于內(nèi)含子2。
　　4個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)為:根據(jù)多態(tài)信息含量(PIC)分類標(biāo)準(zhǔn)(PIC≤0.25，低度多態(tài)性;0.25＜PIC＜0.50，中度多態(tài)性;PIC≥0.50，高度多態(tài)性)，位點(diǎn)529G＞T和590A＞T，屬于高度多態(tài)性位點(diǎn);位點(diǎn)2226A＞G，屬于中度多態(tài)性位點(diǎn);位點(diǎn)509G＞T，屬于低度多態(tài)性位點(diǎn)。4個(gè)SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀(體長(zhǎng)，BL;體重，BW)

20、的相關(guān)性分析表明，在位點(diǎn)2226A＞G，GG基因型的個(gè)體比AA型和GA型個(gè)體擁有更長(zhǎng)的體節(jié)(P＜0.01)和更重的體重(P＜0.05)。
　　本文首次克隆了IAGBP基因的cDNA序列;IAG，IAGB，CHH, GIH和MIH基因組序列;首次研究了IAG和IAGBP基因的相互調(diào)控關(guān)系;首次闡述了CHH家族神經(jīng)激素基因?qū)AG基因的調(diào)控作用;首次在IAG基因組中篩選到與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)。本研究結(jié)果不僅有助于闡明青蝦性別決定