組蛋白修飾與喉癌相關(guān)抑制基因表達(dá)的關(guān)系及藥物調(diào)控的研究.pdf

1、目的:
　　腫瘤發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性不僅體現(xiàn)在由基因突變或缺失導(dǎo)致的遺傳改變，還表現(xiàn)在以DNA甲基化和組蛋白修飾為代表的表遺傳學(xué)改變。如果表遺傳修飾發(fā)生改變，將對(duì)基因的表達(dá)、染色體的濃集、分離、細(xì)胞的凋亡等造成重大影響。腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化能抑制轉(zhuǎn)錄起始，導(dǎo)致基因沉默，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著極其重要的角色。組蛋白修飾可使染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞中催化組蛋白修飾的酶可將其所攜帶的信息傳遞給染色體調(diào)節(jié)因子，最終導(dǎo)致基因表達(dá)的改變

2、。
　　MGMT是一種高效的DNA修復(fù)酶，對(duì)保護(hù)細(xì)胞免受烷化劑損害，防止細(xì)胞癌變和死亡具有極為重要的作用。如果MGMT異常，不能發(fā)揮正常的作用或作用不足，將導(dǎo)致喉癌細(xì)胞DNA中G∶C配對(duì)轉(zhuǎn)換為A∶T配對(duì)，就會(huì)導(dǎo)致癌基因的激活和抑癌基因失活，進(jìn)一步發(fā)展引起腫瘤。RASSF1A是RAS相關(guān)區(qū)域家族1A基因，定位于染色體3p21.3，是Dammann等于2000年克隆到的新基因。Huebner認(rèn)為RASSF1A基因可能是第一個(gè)重要的主要

3、由啟動(dòng)子甲基化而失活的抑癌基因。目前認(rèn)為，RASSF1A可能參與抑制Ras/RASSF1/ERK通路的信號(hào)傳導(dǎo)，阻斷Ras生長(zhǎng)效應(yīng)信號(hào)由細(xì)胞外傳向細(xì)胞內(nèi)，使其喪失介導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖和激活原癌基因的功能，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。
　　喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，我國(guó)東北地區(qū)是其高發(fā)區(qū)。盡管近30年來喉功能保留率已經(jīng)有了很大的提高，但總的5年生存率沒有大的變化。因此，只有不斷完善喉癌發(fā)病機(jī)制的研究并由此開展新的治療方法，才能有

4、效提高喉癌療效和預(yù)后。
　　材料與方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　人喉癌Hep-2細(xì)胞系。選擇2008年1月-2009年5月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻喉科住院的喉鱗狀細(xì)胞癌患者（喉癌組）50例，男44例，女6例，年齡40-74歲，平均58±9.76歲。取全喉切除標(biāo)本距腫瘤2.0cm以上正常喉黏膜組織15例作為對(duì)照組。手術(shù)取下的新鮮標(biāo)本立即浸入液氮中后置于-70℃冰箱保存。喉癌組按2002年UICC喉癌分期標(biāo)準(zhǔn):其中早期

5、（Ⅰ期+Ⅱ期）24例(T1N08例，T2N016例)，聲門上型13例，聲門型11例。中晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）26例(T3N08例，T4N07例，T3N14例，T4N13例，T3N23例，T3N31例)，聲門上型14例，聲門型12例。所有喉癌組織均經(jīng)病理證實(shí)為鱗癌。術(shù)前均未經(jīng)放化療治療。標(biāo)本提取均經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署患者知情同意書。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　Hep-2細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)

6、于含10％胎牛血清RPMI-1640的培養(yǎng)液，NaHC02濃度2g/L，青霉素G濃度100U/L，鏈霉素濃度100μg/L，37℃含5％CO2的濕潤(rùn)空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組
　　(1)對(duì)照組
　　同期培養(yǎng)不加藥的喉癌Hep-2細(xì)胞。
　　(2)實(shí)驗(yàn)組
　　①5-Aza-dC組:5μmol/L5-Aza-dC培養(yǎng)72小時(shí);
　?、赥SA組:加TSA300nmol/L培養(yǎng)24小時(shí);<

7、br>　?、?-Aza-dC聯(lián)合TSA組:加5μmol/L5-Aza-dC48小時(shí)后加TSA300nmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
　　3、引物設(shè)計(jì)
　　MSP、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、CHIP引物序列和反應(yīng)條件見表1-3，引物由TaKaRa公司合成。
　　4、甲基化特異性PCR法檢測(cè)DNA甲基化水平
　　分別提取喉癌細(xì)胞系，喉癌組織中DNA。紫外分光光度儀定性、定量。亞硫酸氫鈉修飾DNA，Wizard DNA Cle

8、an-up Systerm(Promega)純化。離心沉淀DNA。采用甲基化特異性PCR方法。PCR反應(yīng)條件:95℃12 min后，95℃變性30s，各種基因不同退火溫度退火45s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸7min，瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。結(jié)果經(jīng)Alpha Image2000自動(dòng)成像儀成像采集數(shù)據(jù)，分析電泳結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　5、SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤抑制基因

9、mRNA表達(dá)
　　用TRlzol試劑一步法分別提取喉癌細(xì)胞系，喉癌組織總RNA(按說明書進(jìn)行)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。無RNA酶的雙蒸水將cDNA10倍稀釋。進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，由PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△ct方法進(jìn)行相對(duì)定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　6、染色質(zhì)免疫沉淀分析檢測(cè)甲基化H3-K9、乙酰化H3-K9、甲基化H3-K4水平
　　

10、收集細(xì)胞或組織剪碎，甲醛交聯(lián)組蛋白和DNA。酶切后分別加H3-K9，H3-K4甲基化和H3-K9乙酰化抗體，免疫血清或Tris-EDTA緩沖液。收集抗體/蛋白復(fù)合物，沉淀下來的染色質(zhì)通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果經(jīng)Alpha Image2000自動(dòng)成像儀成像采集數(shù)據(jù)，分析電泳結(jié)果。
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS17.0軟件分析，mRNA表達(dá)水平定量測(cè)定結(jié)果用t檢驗(yàn)，甲基化和臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用x2檢驗(yàn)（Fisher，

11、精確概率法），組間相關(guān)分析用Spearman等級(jí)相關(guān)。P＜0.05，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、喉癌組織基因MGMT的甲基化率為54％，RASSF1A的甲基化率為62％，正常對(duì)照組無DNA甲基化。兩種基因在喉癌組織中甲基化情況與年齡，性別，分化程度，臨床T分級(jí)，病理類型和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P＞0.05)。
　　2、喉癌組兩種基因mRNA表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)?；騧RNA表

12、達(dá)在甲基化組明顯低于非甲基化組(P＜0.05)。
　　3、MGMT、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3-K9甲基化狀態(tài)與DNA甲基化狀態(tài)正相關(guān)(P＜0.05)，即DNA甲基化者，H3-K9甲基化程度也高;無甲基化者，H3-K9甲基化程度很低。
　　4、MGMT、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3-K4甲基化狀態(tài)與DNA甲基化負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，即DNA甲基化者，H3-K4甲基化程度低;無甲基化者，H3-K4甲基化

13、程度高。
　　5、MGMT、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3-K9乙?；cDNA甲基化無相關(guān)性（P＞0.05）。
　　6、TSA對(duì)MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3-K9甲基化無影響，但能輕度降低RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3-K9甲基化水平。5-Aza-dC明顯降低兩種基因啟動(dòng)子區(qū)域H3-K9甲基化程度，聯(lián)合給予5-Aza-dC和TSA對(duì)MGMT基因來說與單獨(dú)給予5-Aza-dC的作用相似，但聯(lián)合給予5-Aza

14、-dC和TSA對(duì)RASSF1A基因來說起協(xié)同增效作用。
　　7、5-Aza-dC對(duì)兩種基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3-K4甲基化的作用與對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域H3-K9甲基化的作用恰好相反，5-Aza-dC明顯提高沉默位點(diǎn)H3-K4甲基化程度，TSA對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域H3-K4甲基化輕度提高，聯(lián)合給予5-Aza-dC和TSA有協(xié)同增效作用。
　　8、5-Aza-dC對(duì)MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3-K9乙酰化無作用，TSA明顯提高沉默位點(diǎn)H3-

15、K9乙?；潭龋?lián)合給予5-Aza-dC和TSA對(duì)MGMT基因來說與單獨(dú)給予TSA的作用相似。5-Aza-dC對(duì)RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3-K9乙酰化有增強(qiáng)作用，TSA明顯提高沉默位點(diǎn)H3-K9乙酰化程度，聯(lián)合給予5-Aza-dC和TSA有協(xié)同增效作用。
　　9、5-Aza-dC能降低DNA甲基化，TSA不影響兩種基因DNA甲基化。
　　10、5-Aza-dC可使基因表達(dá)增強(qiáng)，TSA使基因表達(dá)輕度增強(qiáng)，5-Aza

16、-dC及TSA可協(xié)同促進(jìn)基因表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、在人喉癌Hep-2細(xì)胞系及喉癌組織中，MGMT、RASSF1A腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化與基因表達(dá)降低相關(guān)，甲基化抑制劑可使甲基化的MGMT、RASSF1A發(fā)生去甲基化，并使基因表達(dá)增強(qiáng)。
　　2、在喉癌組織中，MGMT、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3-K9甲基化與DNA甲基化正相關(guān)，而組蛋白H3-K4甲基化與DNA的甲基化負(fù)相關(guān)。H3-K9乙酰化

17、與DNA甲基化無相關(guān)性?；騿?dòng)子區(qū)組蛋白H3-K9甲基化與DNA的甲基化在基因的沉默機(jī)制中具有協(xié)同作用，而組蛋白H3-K4甲基化拮抗DNA甲基化所產(chǎn)生的基因沉默。
　　3、在喉癌細(xì)胞系中，甲基化抑制劑可影響MGMT、RASSF1A基因啟動(dòng)予區(qū)組蛋白H3-K9甲基化、H3-K4甲基化，而且與DNA甲基化狀態(tài)相關(guān)，乙酰化制劑可影響MGMT基因的H3-K4甲基化和H3-K9乙?；绊慠ASSF1A基因的H3-K9甲基化、H3-K4甲