海島棉纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、棉纖維是最重要的紡織原料之一，它是由單個(gè)胚珠表皮細(xì)胞分化而來。纖維的發(fā)育歷經(jīng)纖維起始、纖維伸長、次生壁增厚及脫水成熟四個(gè)互有重疊的階段，整個(gè)發(fā)育過程約需55天。纖維細(xì)胞發(fā)育整個(gè)過程只進(jìn)行核內(nèi)復(fù)制而不發(fā)生細(xì)胞分裂，細(xì)胞增長高度同步，是研究細(xì)胞發(fā)育的理想材料。同時(shí)，纖維細(xì)胞的次生細(xì)胞壁幾乎全部由纖維素構(gòu)成，因此，纖維發(fā)育也是研究纖維素生物合成的理想系統(tǒng)。棉纖維發(fā)育是一個(gè)由基因時(shí)序控制的復(fù)雜過程，闡明其機(jī)理將為利用基因工程技術(shù)改良棉纖維品質(zhì)奠

2、定良好的理論基礎(chǔ)。 海島棉是眾多商品棉中纖維最長、品質(zhì)最優(yōu)的品種之一。本研究以海島棉為材料進(jìn)行了纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆以及纖維發(fā)育起始階段的轉(zhuǎn)錄水平研究，利用構(gòu)建的海島棉差減文庫，采用RACE技術(shù)首次在海島棉中克隆了兩條海島棉纖維發(fā)育相關(guān)的全長cDNA，分別命名為GbHBI(GenBank Accession AY966446)和GbABCI(GenBank AccessionDQ359122)。 序列分析發(fā)現(xiàn)，GbH

3、BI基因的全長cDNA為3061bp，具有一個(gè)443 bp的5’非翻譯區(qū)(UTR，untranslated region)和110 bp的3’非翻譯區(qū)及2508bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)由836個(gè)氨基酸組成的蛋白，預(yù)測其分子量為91.6kDa，等電點(diǎn)pI為5.93。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)GbHBI編碼的蛋白包含一個(gè)保守的homeodomain的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈(1eucine-Zipper)的結(jié)構(gòu)域，其中homeodomain由6

4、0個(gè)氨基酸組成，緊隨其后的是由28個(gè)氨基酸組成的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，GbHBl蛋白屬于HD-zip蛋白家族，多重序列及結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)GbHBl基因?qū)儆诘贗II亞家族。HD-Zip家族是目前發(fā)現(xiàn)的植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其中的第III亞家族主要與植物細(xì)胞的生長發(fā)育密切相關(guān)。@ Southem雜交結(jié)果顯示，GbHBl在海島棉基因組中屬于低拷貝基因。RT-PCR研究表明，GbHBl為器官差異性表達(dá)基因，在發(fā)育中的胚珠和莖中的表達(dá)量最高，而在葉和

5、子葉中表達(dá)極低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GbHBl在0-2DPA(day post anthesis)的胚珠中表達(dá)量最高，并且一直持續(xù)這種高表達(dá)到3DPA時(shí)略有降低，直到15DPA后才開始明顯降低。該結(jié)果表明，GbHBl主要在纖維伸長階段呈現(xiàn)出高表達(dá)，預(yù)示著GbHBl轉(zhuǎn)錄因子可能參與了纖維伸長階段的發(fā)育調(diào)控。為了進(jìn)一步驗(yàn)GbHBl的功能，構(gòu)建了含有由CaMV35S啟動(dòng)子引導(dǎo)的GbHBl基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-GbHBl，通過農(nóng)

6、桿菌GV3101介導(dǎo)，利用花浸染法成功轉(zhuǎn)化了擬南芥微管束束間纖維發(fā)育的突變體ifll。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ifll中過量表達(dá)GbHBl基因能使突變體的莖干柔軟下垂表型恢復(fù)到野生型的直立狀態(tài)。證明GbHBl基因與擬南芥IFLl基因的功能類似，和束間纖維的發(fā)育相關(guān)。 序列分析發(fā)現(xiàn)，GbABCl基因的全長cDNA為3424lbp，包括一個(gè)3213bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)由1071個(gè)氨基酸組成的蛋白，該蛋白的預(yù)測分子量為118.4kD，等電

7、點(diǎn)為6.19，和其他同類的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的大小類似。GbABCl基因的cDNA含有長度為12bp的5'UTR和199bp的3'端非編碼區(qū)，其UTR部分比其他同類基因的短。GbABCl蛋白與擬南芥ATMRP3蛋白的同源性最高，為73％，與遏藍(lán)菜(Thlaspicaerulescens)多藥抗性相關(guān)蛋白的同源性為72％，和水稻的MRP-1ikeABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有68％的同源性，和其他物種的MRP家族蛋白也有較高的相似性，推斷GbABCl基因

8、屬于MRP基因家族。利用ScanProsite搜索結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，GbABCl和數(shù)據(jù)庫中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域，其中在1-166氨基酸和510-790氨基酸區(qū)域分別存在一個(gè)跨膜區(qū)；在200-423氨基酸和827-1061氨基酸區(qū)域分別存在一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)。從結(jié)構(gòu)域的組織形式來看，GbABCl屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類，其組織形式為“TMDl-NBFl-TMD2-NBF2”模式。推測其功能可能與纖維發(fā)育過程中的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)

9、有關(guān)。 棉纖維的起始分化發(fā)生在開花前一天(-1DPA)與開花后一天(1DPA)之間，隨即進(jìn)入迅速伸長階段。為了研究棉纖維發(fā)育早期的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用含12000個(gè)EST(espressed sequence tag)點(diǎn)陣的棉纖維cDNA芯片對-1DPA和1DPA的胚珠中基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)階段的基因轉(zhuǎn)錄水平存在很大的差異，二者差異表達(dá)的ESq?’達(dá)1376個(gè)，其中在．1DPA表達(dá)下調(diào)的EST為1072個(gè)，表達(dá)

10、上調(diào)的EST。為304個(gè)。差異表達(dá)的EST可能與棉花纖維發(fā)育的起始相關(guān)，表明纖維的起始發(fā)育受到復(fù)雜的多基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，而這種基因表達(dá)的差異可能也與受精和隨后纖維發(fā)育的細(xì)胞分化有關(guān)。通過數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)的EST大部分參與核酸和蛋白合成代謝，其次參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，這些都是細(xì)胞生長發(fā)育所必需的。其中，在差異表達(dá)的EST中也檢測到了所發(fā)現(xiàn)的和棉花纖維發(fā)育密切相關(guān)的基因的同源序列，如HD-Zip家族和Myb家族以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的