棉纖維起始發(fā)育的基因表達(dá)譜及茉莉酸代謝途徑與纖維起始發(fā)育關(guān)系.pdf

1、棉花既是重要的纖維作物，又是重要的油料作物。棉纖維由胚珠外珠被表皮細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)，其發(fā)育過(guò)程分為起始、伸長(zhǎng)、次生壁加厚和脫水成熟四個(gè)相互獨(dú)立而又互有重疊的階段。纖維發(fā)育突變體是非常有價(jià)值的研究材料，有助于我們更好的探索纖維發(fā)育相關(guān)基因的分子調(diào)控機(jī)制。目前，棉花上已報(bào)道了多個(gè)纖維突變體材料。其中新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨無(wú)絮(XinWX)為起始發(fā)育突變體，成熟的棉籽表面無(wú)長(zhǎng)纖維和短絨。新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨有絮(XinFLM)材料為來(lái)源于XinWX的光籽突變體

2、，表現(xiàn)為成熟棉籽表面有長(zhǎng)纖維無(wú)短絨。遺傳分析表明XinFLM是XinWX控制纖維發(fā)育基因發(fā)生顯性突變?cè)斐傻?，兩者在棉纖維發(fā)育上僅有一個(gè)位點(diǎn)的差異。本研究以XinWX和XinFLM為研究材料，通過(guò)高通量cDNA芯片技術(shù)分析比較了這兩個(gè)材料在纖維發(fā)育起始期的表達(dá)譜差異，旨在發(fā)現(xiàn)纖維起始發(fā)育過(guò)程中起重要作用的基因或代謝途徑。主要研究結(jié)果如下:
　　1.新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨無(wú)絮(XinWX)和新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨有絮(XinFLM)成熟棉籽的形態(tài)特征表明

3、，XinFLM有長(zhǎng)纖維無(wú)短絨，而XinWX既無(wú)長(zhǎng)纖維也無(wú)短絨。電鏡觀察表明，XinWX在-1 DPA、0 DPA、1 DPA胚珠表面均未見(jiàn)任何纖維細(xì)胞的突起。XinFLM在-1 DPA胚珠表面未見(jiàn)任何突起，而在0 DPA胚珠表面發(fā)現(xiàn)纖維細(xì)胞開(kāi)始大量突起，1 DPA纖維突起數(shù)目繼續(xù)增多，且部分突起細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始伸長(zhǎng)。說(shuō)明XinWX為纖維起始發(fā)育缺陷材料，而XinFLM纖維的突起發(fā)生在開(kāi)花當(dāng)天。
　　2.利用含29，184個(gè)纖維發(fā)育相關(guān)

4、探針的cDNA芯片比較分析XinWX和XinFLM材料在-1 DPA、0 DPA、1 DPA纖維發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)譜差異，對(duì)同一材料不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)以及同一發(fā)育時(shí)間點(diǎn)兩個(gè)材料間的差異基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。通過(guò)比較0 vs-1DPA，1 vs0 DPA，1 vs-1 DPA發(fā)育階段的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)在XinFLM中的差異表達(dá)基因數(shù)（foldchange＞2倍，F(xiàn)DR＜0.05）均高于XinWX，表明在XinFLM中有大量基因參與纖維的起始發(fā)育。兩

5、個(gè)材料在相同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)差異分析表明，在-1DPA、0 DPA、1 DPA3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異基因數(shù)分別為834、357、1000。在0 DPA差異基因數(shù)最少，1 DPA的差異基因數(shù)最多。推測(cè)由于0 DPA XinFLM纖維已經(jīng)開(kāi)始突起，一些參與纖維發(fā)育的基因在-1 DPA表現(xiàn)的更為活躍。在1 DPA，大量參與早期纖維伸長(zhǎng)的基因開(kāi)始行使功能。
　　3.利用Blast2GO軟件對(duì)所有差異基因進(jìn)行GO功能注釋及富集分析。結(jié)果顯示在同一

6、材料不同發(fā)育時(shí)期以及不同材料相同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的差異基因均多次富集到參與氧化還原、激素合成代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)進(jìn)程，說(shuō)明上述途徑在纖維起始發(fā)育過(guò)程中扮演重要的角色。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)錄因子也表現(xiàn)為顯著差異表達(dá)。其中12個(gè)ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子成員表達(dá)一致，均表現(xiàn)為在-1 DPA或0 DPA的XinFLM中共上調(diào)表達(dá)，定量分析驗(yàn)證了這一結(jié)果。說(shuō)明ERF類(lèi)家族基因參與纖維起始發(fā)育調(diào)控。差異表達(dá)譜分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與茉莉酸合成相關(guān)的AO

7、C基因均在XinWX中共上調(diào)表達(dá)，而與油菜素內(nèi)酯代謝相關(guān)基因則在XinFLM中共上調(diào)表達(dá)。表明茉莉酸在纖維起始發(fā)育過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用，而油菜素內(nèi)酯則起正調(diào)控作用。
　　4.富集分析表明參與茉莉酸合成的AOC相關(guān)基因均在XinWX中共上調(diào)表達(dá)。為了闡明AOC家族基因表達(dá)與棉纖維發(fā)育關(guān)系，以已克隆的GhAOC保守域序列為探針在公開(kāi)釋放的D基因組序列信息中共搜索到4個(gè)AOC類(lèi)基因(Gorai.004G046300，Gorai.008G1

8、85600, Gorai.004G046400, Gorai.004G046100)。其中Gorai.004G046100與TM-1已克隆的GhAOC是同源基因，其余3個(gè)AOC在TM-1中相應(yīng)的同源序列分別命名為GhAOC2(Gorai.004G046300),GhAOC3(Gorai.004G046400),GhAOC4(Gorai.008G185600)。TM-1不同組織器官以及纖維發(fā)育期的定量表達(dá)分析表明，4個(gè)AOC基因均在纖維起

9、始發(fā)育期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，尤其在-1 DPA表達(dá)水平較高，暗示AOC基因可能參與棉纖維的起始發(fā)育。進(jìn)一步檢測(cè)這4個(gè)基因在不同纖維發(fā)育突變體起始期-3～3 DPA的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因具有相似的表達(dá)趨勢(shì)，在無(wú)絮突變體中的表達(dá)顯著高于有絮材料，并且在-1 DPA達(dá)到表達(dá)高峰，推測(cè)過(guò)高AOC轉(zhuǎn)錄水平可能抑制纖維的發(fā)育。綜合上述分析，AOC參與纖維的起始發(fā)育，但過(guò)表達(dá)抑制纖維發(fā)育。
　　5.前人報(bào)道JA與合成JA的相關(guān)酶間存在反饋調(diào)節(jié)。AOC

10、是合成JA的關(guān)鍵酶。利用JA活體和離體處理棉花材料，以闡明JA與AOC關(guān)系。4個(gè)AOC基因都受到JA誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)趨勢(shì)一致。JA處理4h后AOC轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，并持續(xù)到12h，在8h達(dá)到表達(dá)高峰，說(shuō)明AOC基因受JA誘導(dǎo)表達(dá)。推測(cè)在纖維起始發(fā)育過(guò)程中，內(nèi)源JA水平的增高誘導(dǎo)AOC的高表達(dá)，而AOC的表達(dá)又進(jìn)一步調(diào)控了植物體內(nèi)的JA動(dòng)態(tài)平衡。為了研究JA與纖維起始發(fā)育關(guān)系，進(jìn)一步檢測(cè)參與JA合成或代謝途徑且在起始期差異表達(dá)的7個(gè)基因進(jìn)

11、行定量分析，結(jié)果顯示這7個(gè)基因都在XinWX纖維起始期上調(diào)表達(dá)，且在-1 DPA差異最明顯，與AOC基因的表達(dá)一致。說(shuō)明在XinWX起始期可能具有高水平的JA，從而抑制纖維的發(fā)育。通過(guò)采集-2 DPA的胚珠，在添加不同濃度JA的培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)2天，電鏡觀察JA濃度對(duì)纖維發(fā)育的影響。結(jié)果表明外源添加0.1μM JA就可明顯抑制纖維的啟動(dòng)，隨著濃度增大，抑制效果更加明顯，添加2.5μM JA胚珠表面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)纖維的突起。表明JA參與纖維的起