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文檔簡(jiǎn)介
1、棉纖維是重要的紡織工業(yè)原料,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人民生活中占有重要的位置。棉纖維是由棉花胚珠外珠被表皮層的單細(xì)胞發(fā)育而成,在受精后約16天,棉纖維細(xì)胞可延伸至2.5-3.0cm。棉纖維發(fā)育過(guò)程中合成大量的纖維素與非纖維素多糖參與纖維形態(tài)的建成,這一發(fā)育過(guò)程有眾多的糖類物質(zhì)參與,進(jìn)行了復(fù)雜的生化代謝反應(yīng),因此棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆既具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值,也有助于植物細(xì)胞發(fā)育以及纖維素合成分子機(jī)理的闡明。 本研究從優(yōu)質(zhì)材料7235不同
2、發(fā)育時(shí)期的棉纖維混合cDNA文庫(kù)中分離出五個(gè)cDNA克?。?1)陸地棉纖維表達(dá)蛋白(cotton fiber expressed protein,GhCFE)(GenBank登錄號(hào):DQ073045),該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度為1274bp,開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為996bp,編碼331個(gè)氨基酸,Blastx結(jié)果表明,該cDNA序列與已報(bào)道的3個(gè)陸地棉纖維表達(dá)蛋白cDNA克隆相似性均很高,與CFEl,CFE2和CFE3分別達(dá)到了95%,98%
3、和96%;(2)2,5-二羥苯乙酸1,2-加雙氧酶(homogentisate1.2-dioxygenase,HGD),該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度為1697bp,開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1422bp,編碼473個(gè)氨基酸,Blastx結(jié)果表明,該cDNA序列與已報(bào)道的番茄(Lvcopersicon esculentum)的2,5-二羥苯乙酸1,2-加雙氧酶(homogentisate1.2-dioxygenase)的相似性為84%,與擬南芥(Ar
4、abidopsis thaliana)的2,5-二羥苯乙酸1,2-加雙氧酶(homogentisate 1,2-dioxygenase)(At5g54080)相似性為81%;(3)兩個(gè)過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD),其中一個(gè)是利用5’RACE技術(shù)得到的長(zhǎng)度為1489bp的完整cDNA序列,開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為816bp,編碼271個(gè)氨基酸,Blastx結(jié)果表明,該基因最大的ORF編碼的氨基酸和擬南芥中一個(gè)過(guò)氧化物酶基因的氨基酸相
5、似性為70%,我們將其命名為GhPODl;另一個(gè)cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度為1355bp,開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為999bp,編碼332個(gè)氨基酸,Blastx結(jié)果表明,該cDNA序列與已報(bào)道的陸地棉纖維過(guò)氧化物酶基因(pod8,L08199)相似性很高,達(dá)到了99%,并且氨基酸比較也基本相似,將其命名為GhPOD2;(4)果膠裂解酶(pectate lyase,PL),該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度為1539bp,開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1236bp,編碼4
6、11個(gè)氨基酸,Blastx比較結(jié)果顯示,我們克隆的這個(gè)cDNA序列與蘋(píng)果(Malus x domestica)的一個(gè)果膠裂解酶相似性最高,達(dá)到85%,與辣椒(Capsicum annuum)、草莓(Fragariax ananassa)、百日菊(Zinnia elegans)、葡萄(Vtis vinifera)等物種的果膠裂解酶也都有一定的相似性。因此,我們將這個(gè)基因命名為GhPL,它在棉花中是首次報(bào)道(GenBank登錄號(hào):DQ073
7、046)。 我們采用SignalP程序?qū)@五個(gè)基因進(jìn)行了N端信號(hào)肽預(yù)測(cè),除了GhHGD沒(méi)有典型的信號(hào)肽,其余四個(gè)基因都有典型的信號(hào)肽,說(shuō)明這四個(gè)基因可能是分泌蛋白。并且對(duì)這五個(gè)基因進(jìn)行了保守區(qū)域及進(jìn)化樹(shù)分析等。 從表達(dá)特征來(lái)看,GhCFE在根、莖中都不表達(dá),在葉中微弱表達(dá),在胚珠和纖維細(xì)胞中表達(dá),并在開(kāi)花后5~20天的纖維中持續(xù)高效表達(dá),20天后減弱,是一個(gè)棉纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因;GhHGD在根、莖、葉、胚珠和纖維細(xì)胞中都
8、表達(dá),但是在葉、開(kāi)花后1天和3天的胚珠中表達(dá)較弱,在開(kāi)花后5天的纖維中表達(dá)增強(qiáng),在17天的纖維中表達(dá)又減弱,所以該基因是一個(gè)在開(kāi)花后5天到14天的纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因;GhHGD在根中不表達(dá),在莖、葉、胚珠和纖維細(xì)胞中表達(dá),并在開(kāi)花后14天的纖維中表達(dá)開(kāi)始逐漸減弱;GhPL在根、莖、葉中都不表達(dá),在纖維和胚珠中表達(dá),是一個(gè)棉纖維特異表達(dá)基因;GhHGDl是組成性表達(dá)的基因。 soutllem雜交結(jié)果表明這五個(gè)基因在陸地棉基因組中
9、都存在兩個(gè)拷貝,其中A,D亞組中各有一個(gè)拷貝。 我們GhCFED,GhPL構(gòu)建了pBll21-35s啟動(dòng)子正義載體及E6啟動(dòng)子正義和反義載體,對(duì)GhPOD2構(gòu)建了pBll21-35s啟動(dòng)子正義和反義載體,并對(duì)GhPL構(gòu)建了RNAl載體,現(xiàn)在正在進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。 將GhHFE,GhHGD和GhPL入酵母表達(dá)載體pREP5N,通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,結(jié)果表明GhHGD的導(dǎo)入使酵母細(xì)胞在長(zhǎng)度及長(zhǎng)/寬上有顯著差異,G
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