昆蟲病原線蟲發(fā)育相關基因的鑒定以及spi-583基因的克隆與表達.pdf

1、斯氏屬(Steinernema)與異小桿屬(Heterorhabditis)昆蟲病原線蟲(EntomopathogenicNematode)是國際上新型的生物殺蟲劑，其感染期幼蟲在食物信息的誘導下恢復、發(fā)育以及大量繁殖，在這類線蟲的產業(yè)化培養(yǎng)中發(fā)揮著重要作用。了解線蟲在恢復發(fā)育過程中差異表達的基因對探討其代謝途徑具有十分重要的意義。 本論文通過構建無菌小卷蛾斯氏線蟲SteinernemacarpocapsaeA24在共生細菌上

2、清液誘導后恢復發(fā)育時的cDNA文庫，篩選差異表達的基因，并將其中一個與線蟲生長發(fā)育密切相關的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因進行了原核表達。 論文敘述了分離共生細菌上清液誘導后恢復發(fā)育的SteinernemacarpocapsaeA24線蟲總RNA，通過RLM-RACE(RNAligasemediatedRapidAmplificationcDNAEnd，RLM-RACE)技術獲得了全長的cDNA文庫，通過點雜交，篩選到48個差異表達的

3、克隆，經測序和生物信息學分析獲得34個DNA序列，這些序列按照蛋白質功能包括多個核糖體大小亞基蛋白(ribosomalprotein)、延伸因子(translationelongationfactor1-alpha)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(serineproteinaseinhibitor)、細胞分裂蛋白激酶(celldivisionproteinkinase5)等。 以SteinernemacarpocapsaeA24總RNA

4、為模板，通過RT-PCR擴增獲得了spi-583基因，將目的基因與pET-15b表達載體進行體外連接，構建了重組表達載體pET-15b-spi-583；經傳代實驗證明了重組質粒pET-15b-spi-583在重組大腸桿菌中的穩(wěn)定性；于重組菌的對數生長期前期加入誘導劑IPTG(1mmol/L)，25℃下誘導表達8h～12h后，獲得分子量約為19.54kDa的融合蛋白；融合蛋白以包涵體形式存在，胞外未有目的蛋白的滲漏表達；利用His·Tag