昆蟲病原線蟲發(fā)育相關(guān)基因的鑒定以及spi-583基因的克隆與表達(dá).pdf

1、斯氏屬(Steinernema)與異小桿屬(Heterorhabditis)昆蟲病原線蟲(EntomopathogenicNematode)是國際上新型的生物殺蟲劑，其感染期幼蟲在食物信息的誘導(dǎo)下恢復(fù)、發(fā)育以及大量繁殖，在這類線蟲的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)中發(fā)揮著重要作用。了解線蟲在恢復(fù)發(fā)育過程中差異表達(dá)的基因?qū)μ接懫浯x途徑具有十分重要的意義。 本論文通過構(gòu)建無菌小卷蛾斯氏線蟲SteinernemacarpocapsaeA24在共生細(xì)菌上

2、清液誘導(dǎo)后恢復(fù)發(fā)育時(shí)的cDNA文庫，篩選差異表達(dá)的基因，并將其中一個(gè)與線蟲生長發(fā)育密切相關(guān)的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因進(jìn)行了原核表達(dá)。 論文敘述了分離共生細(xì)菌上清液誘導(dǎo)后恢復(fù)發(fā)育的SteinernemacarpocapsaeA24線蟲總RNA，通過RLM-RACE(RNAligasemediatedRapidAmplificationcDNAEnd，RLM-RACE)技術(shù)獲得了全長的cDNA文庫，通過點(diǎn)雜交，篩選到48個(gè)差異表達(dá)的

3、克隆，經(jīng)測序和生物信息學(xué)分析獲得34個(gè)DNA序列，這些序列按照蛋白質(zhì)功能包括多個(gè)核糖體大小亞基蛋白(ribosomalprotein)、延伸因子(translationelongationfactor1-alpha)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(serineproteinaseinhibitor)、細(xì)胞分裂蛋白激酶(celldivisionproteinkinase5)等。 以SteinernemacarpocapsaeA24總RNA

4、為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得了spi-583基因，將目的基因與pET-15b表達(dá)載體進(jìn)行體外連接，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-15b-spi-583；經(jīng)傳代實(shí)驗(yàn)證明了重組質(zhì)粒pET-15b-spi-583在重組大腸桿菌中的穩(wěn)定性；于重組菌的對數(shù)生長期前期加入誘導(dǎo)劑IPTG(1mmol/L)，25℃下誘導(dǎo)表達(dá)8h～12h后，獲得分子量約為19.54kDa的融合蛋白；融合蛋白以包涵體形式存在，胞外未有目的蛋白的滲漏表達(dá)；利用His·Tag