家蠶精巢蛋白表達(dá)譜分析及精子形成的相關(guān)研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori，L.)不僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是一種有中國(guó)特色的重要模式生物。家蠶基因組計(jì)劃推動(dòng)了家蠶模式化生物系統(tǒng)研究，從基因組到蛋白質(zhì)組是家蠶研究的自然進(jìn)程。
　　 以蛋白質(zhì)組學(xué)為主要內(nèi)容的家蠶功能基因組研究對(duì)于加快家蠶模式化研究進(jìn)程、建立現(xiàn)代蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、推動(dòng)蠶絲產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的意義。建立家蠶蛋白組研究技術(shù)平臺(tái)，利用家蠶開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型替代，也是家蠶模式化生物系統(tǒng)研究的重要任務(wù)。
　　 精巢

2、是雄蠶內(nèi)部生殖器官，精子形成的場(chǎng)所。和大部分鱗翅目昆蟲一樣，家蠶具有精子二型性：上蔟吐絲前產(chǎn)生有核精子，之后則產(chǎn)生無(wú)核精子。精子形成過(guò)程，受到多種調(diào)控機(jī)制的影響：激素調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、生態(tài)因子調(diào)控、基因調(diào)控等。研究家蠶精子形成和二型分化的分子機(jī)制，有助于搞清家蠶性別決定和分化、實(shí)現(xiàn)性別控制，達(dá)到提高絲質(zhì)、專養(yǎng)雄蠶；有助于尋找優(yōu)良品種選育所需要的蛋白分子標(biāo)記；有利于發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥的生殖毒性新靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)新農(nóng)藥貢獻(xiàn)于農(nóng)業(yè)害蟲控制；有助于加深對(duì)雄性生殖

3、發(fā)生、生殖障礙、生殖調(diào)控分子機(jī)制等生殖相關(guān)基礎(chǔ)生物學(xué)的認(rèn)識(shí)。
　　 本文利用shotgun LC-MS/MS和雙向電泳的方法，鑒定了家蠶5齡幼蟲和蛹中期精巢蛋白質(zhì)組；建立了家蠶5齡幼蟲和蛹期的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)譜圖，并對(duì)5齡起蠶和化蛾前精巢部分差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了鑒定；對(duì)部分精子形成相關(guān)基因進(jìn)行了定量分析。建立了生精囊體外培養(yǎng)系，測(cè)定了雙酚A對(duì)家蠶生精囊體外形成精子的影響。本研究為家蠶功能基因研究和新農(nóng)藥作用靶標(biāo)開(kāi)發(fā)提供了大量的研究

4、對(duì)象，并對(duì)利用家蠶開(kāi)發(fā)環(huán)境激素初篩、生殖毒理研究動(dòng)物模型做了一些探討。
　　 1.家蠶精巢shotgun法蛋白組表達(dá)譜鑒定利用家蠶預(yù)測(cè)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(silkDB：silkdatabase)和NCBI(National Center forBiotechnology Information)上已有家蠶蛋白，建立本地家蠶蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。用shotgun LCMS/MS法鑒定了家蠶5齡幼蟲和蛹中期精巢蛋白質(zhì)組，分別獲得753和498種蛋白質(zhì)

5、，其中二者共有蛋白為351種。建立了共有900種蛋白的家蠶精巢蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)，為家蠶精巢功能基因組研究，新農(nóng)藥靶標(biāo)開(kāi)發(fā)提供了大量研究對(duì)象。
　　 鑒定蛋白的預(yù)測(cè)分子量、等電點(diǎn)分析表明，精巢中酸性蛋白稍多，蛹期以后大分子量蛋白比例減少。GO注釋(Gene Ontology Annotation)分析表明，主要鑒定蛋白屬于細(xì)胞組分、細(xì)胞器和大分子復(fù)合物；大部分蛋白參與代謝和細(xì)胞過(guò)程，并發(fā)現(xiàn)了多種與外部刺激響應(yīng)有關(guān)的熱激蛋白。分子功能注

6、釋表明鑒定的蛋白主要和催化、綁定功能有關(guān)。分析還發(fā)現(xiàn)精巢中有大量和色素沉積相關(guān)蛋白。5齡幼蟲和蛹中期精巢差異表達(dá)蛋白GO分析表明，二者在細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞器成分上有明顯差異；核苷酸、核酸、GTP結(jié)合蛋白等方面在數(shù)目和功能上差異顯著；而在生物過(guò)程的差異主要表現(xiàn)在翻譯和翻譯后修飾方面。具體比較了兩者之間在核蛋白上的差異。
　　 2.家蠶精巢蛋白組雙向電泳研究對(duì)家蠶5齡起蠶到化蛾前家蠶精巢進(jìn)行了雙向電泳分析，建立了5齡幼蟲和蛹期精巢蛋白質(zhì)

7、組雙向電泳的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。并利用MALDI TOF/TOF質(zhì)譜鑒定了22個(gè)差異或特異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，獲得其中9個(gè)家蠶蛋白，分別是：Ssu72蛋白(Ssu72 RNApolymeraseⅡ CTD phosphatase)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporter)、神經(jīng)鈣蛋白(海馬鈣結(jié)合蛋白)類似物(neurocalcin homolog；hippocalcin)、未知蛋白(BGIBMGA014561-PA)、Tar DNA結(jié)合蛋白類似

8、物(TBPH：TAR DNA bindingprotein homolog)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶ε2(glutathione S-transferase sigma2)、伴侶素(chaperonin)、熱激蛋白19.5(19.5 kDa heat shock protein)、熱激蛋白20.1(heat shockprotein20.1)、熱休克共軛蛋白(heat shock cognate protein)。
　　 3.家蠶精巢

9、熱激蛋白、細(xì)胞周期蛋白家族基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析對(duì)不同發(fā)育時(shí)相家蠶精巢中熱激蛋白和細(xì)胞周期蛋白家族基因，進(jìn)行了的轉(zhuǎn)錄水平分析。發(fā)現(xiàn)家蠶精巢中，熱激蛋白家族hsp20.1(hsp：hot shock protein)、hsp20.4、hsp20.8相對(duì)表達(dá)量比較大，在5齡中期和化蛹前后有表達(dá)高峰，化蛾前迅速降低；hsp25.4、hsp70、hsp90表達(dá)量相對(duì)比較少。推測(cè)，小分子熱激動(dòng)蛋白與精子形成有密切關(guān)系。而細(xì)胞周期蛋白家族中cycl

10、inB轉(zhuǎn)錄表達(dá)量最高，cyclinA非常少且隨著發(fā)育進(jìn)程變動(dòng)不大。轉(zhuǎn)錄變動(dòng)規(guī)律來(lái)看cyclinB最高和cyclinL1最相似，可能兩者具有協(xié)同作用。
　　 4.雙酚A對(duì)體外培養(yǎng)家蠶生精囊形成精子的影響建立了家蠶5齡起蠶到化蛾階段精子發(fā)育進(jìn)程的標(biāo)準(zhǔn)譜圖，觀察到有核和無(wú)核精子在分化成熟中的形態(tài)差異。
　　 建立了家蠶生精囊體外培養(yǎng)體系，并嘗試?yán)秒p酚A作為低毒環(huán)境激素模式藥物，研究了環(huán)境激素對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育和精子發(fā)生形成的影響