家蠶精巢蛋白表達譜分析及精子形成的相關研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori，L.)不僅是一種重要的經濟昆蟲，也是一種有中國特色的重要模式生物。家蠶基因組計劃推動了家蠶模式化生物系統(tǒng)研究，從基因組到蛋白質組是家蠶研究的自然進程。
　　 以蛋白質組學為主要內容的家蠶功能基因組研究對于加快家蠶模式化研究進程、建立現代蠶桑產業(yè)技術體系、推動蠶絲產業(yè)發(fā)展具有重要的意義。建立家蠶蛋白組研究技術平臺，利用家蠶開發(fā)實驗動物模型替代，也是家蠶模式化生物系統(tǒng)研究的重要任務。
　　 精巢

2、是雄蠶內部生殖器官，精子形成的場所。和大部分鱗翅目昆蟲一樣，家蠶具有精子二型性：上蔟吐絲前產生有核精子，之后則產生無核精子。精子形成過程，受到多種調控機制的影響：激素調控、營養(yǎng)調控、生態(tài)因子調控、基因調控等。研究家蠶精子形成和二型分化的分子機制，有助于搞清家蠶性別決定和分化、實現性別控制，達到提高絲質、專養(yǎng)雄蠶；有助于尋找優(yōu)良品種選育所需要的蛋白分子標記；有利于發(fā)現農藥的生殖毒性新靶標，開發(fā)新農藥貢獻于農業(yè)害蟲控制；有助于加深對雄性生殖

3、發(fā)生、生殖障礙、生殖調控分子機制等生殖相關基礎生物學的認識。
　　 本文利用shotgun LC-MS/MS和雙向電泳的方法，鑒定了家蠶5齡幼蟲和蛹中期精巢蛋白質組；建立了家蠶5齡幼蟲和蛹期的蛋白質標準表達譜圖，并對5齡起蠶和化蛾前精巢部分差異表達蛋白點進行了鑒定；對部分精子形成相關基因進行了定量分析。建立了生精囊體外培養(yǎng)系，測定了雙酚A對家蠶生精囊體外形成精子的影響。本研究為家蠶功能基因研究和新農藥作用靶標開發(fā)提供了大量的研究

4、對象，并對利用家蠶開發(fā)環(huán)境激素初篩、生殖毒理研究動物模型做了一些探討。
　　 1.家蠶精巢shotgun法蛋白組表達譜鑒定利用家蠶預測蛋白數據庫(silkDB：silkdatabase)和NCBI(National Center forBiotechnology Information)上已有家蠶蛋白，建立本地家蠶蛋白數據庫。用shotgun LCMS/MS法鑒定了家蠶5齡幼蟲和蛹中期精巢蛋白質組，分別獲得753和498種蛋白質

5、，其中二者共有蛋白為351種。建立了共有900種蛋白的家蠶精巢蛋白組數據庫，為家蠶精巢功能基因組研究，新農藥靶標開發(fā)提供了大量研究對象。
　　 鑒定蛋白的預測分子量、等電點分析表明，精巢中酸性蛋白稍多，蛹期以后大分子量蛋白比例減少。GO注釋(Gene Ontology Annotation)分析表明，主要鑒定蛋白屬于細胞組分、細胞器和大分子復合物；大部分蛋白參與代謝和細胞過程，并發(fā)現了多種與外部刺激響應有關的熱激蛋白。分子功能注

6、釋表明鑒定的蛋白主要和催化、綁定功能有關。分析還發(fā)現精巢中有大量和色素沉積相關蛋白。5齡幼蟲和蛹中期精巢差異表達蛋白GO分析表明，二者在細胞內部和細胞器成分上有明顯差異；核苷酸、核酸、GTP結合蛋白等方面在數目和功能上差異顯著；而在生物過程的差異主要表現在翻譯和翻譯后修飾方面。具體比較了兩者之間在核蛋白上的差異。
　　 2.家蠶精巢蛋白組雙向電泳研究對家蠶5齡起蠶到化蛾前家蠶精巢進行了雙向電泳分析，建立了5齡幼蟲和蛹期精巢蛋白質

7、組雙向電泳的標準圖譜。并利用MALDI TOF/TOF質譜鑒定了22個差異或特異表達的蛋白點，獲得其中9個家蠶蛋白，分別是：Ssu72蛋白(Ssu72 RNApolymeraseⅡ CTD phosphatase)、ABC轉運蛋白(ABC transporter)、神經鈣蛋白(海馬鈣結合蛋白)類似物(neurocalcin homolog；hippocalcin)、未知蛋白(BGIBMGA014561-PA)、Tar DNA結合蛋白類似

8、物(TBPH：TAR DNA bindingprotein homolog)、谷胱甘肽S轉移酶ε2(glutathione S-transferase sigma2)、伴侶素(chaperonin)、熱激蛋白19.5(19.5 kDa heat shock protein)、熱激蛋白20.1(heat shockprotein20.1)、熱休克共軛蛋白(heat shock cognate protein)。
　　 3.家蠶精巢

9、熱激蛋白、細胞周期蛋白家族基因的轉錄表達水平分析對不同發(fā)育時相家蠶精巢中熱激蛋白和細胞周期蛋白家族基因，進行了的轉錄水平分析。發(fā)現家蠶精巢中，熱激蛋白家族hsp20.1(hsp：hot shock protein)、hsp20.4、hsp20.8相對表達量比較大，在5齡中期和化蛹前后有表達高峰，化蛾前迅速降低；hsp25.4、hsp70、hsp90表達量相對比較少。推測，小分子熱激動蛋白與精子形成有密切關系。而細胞周期蛋白家族中cycl

10、inB轉錄表達量最高，cyclinA非常少且隨著發(fā)育進程變動不大。轉錄變動規(guī)律來看cyclinB最高和cyclinL1最相似，可能兩者具有協(xié)同作用。
　　 4.雙酚A對體外培養(yǎng)家蠶生精囊形成精子的影響建立了家蠶5齡起蠶到化蛾階段精子發(fā)育進程的標準譜圖，觀察到有核和無核精子在分化成熟中的形態(tài)差異。
　　 建立了家蠶生精囊體外培養(yǎng)體系，并嘗試利用雙酚A作為低毒環(huán)境激素模式藥物，研究了環(huán)境激素對家蠶生長發(fā)育和精子發(fā)生形成的影響