有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)后家蠶脂肪體特征蛋白及其基因的表達(dá)分析.pdf

1、近年來(lái)，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行和完成，生命科學(xué)的研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代。在這一時(shí)代，生命科學(xué)的主要研究對(duì)象已經(jīng)從基因組學(xué)研究逐漸向功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞代謝組學(xué)等研究轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物創(chuàng)新研究，成為功能基因組學(xué)中最重要的核心技術(shù)之一。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門(mén)在整個(gè)細(xì)胞水平甚至整體水平上研究各種蛋白質(zhì)的性能，如表達(dá)水平、翻譯后修飾等，以便在蛋白質(zhì)水平上獲得一個(gè)細(xì)胞和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的總體的生理生化進(jìn)程。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

2、也適用于同時(shí)進(jìn)行數(shù)百甚至數(shù)千種蛋白質(zhì)的分析。隨著有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑在農(nóng)作物和人類(lèi)生活害蟲(chóng)防治中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致大量害蟲(chóng)產(chǎn)生了抗藥性。家蠶(Bombyx mori)是鱗翅目昆蟲(chóng)的模式生物，由于家蠶與鱗翅目害蟲(chóng)在生理生化及農(nóng)藥代謝機(jī)制方面具有相似性，對(duì)家蠶進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥抗性的研究，將為鱗翅目害蟲(chóng)的防治和家蠶抗性品種的選育提供一定的理論依據(jù)。本文以家蠶品種大造為研究材料，測(cè)定了有機(jī)磷農(nóng)藥辛硫磷對(duì)5齡3d雌雄家蠶的毒力，通過(guò)比較家蠶在有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)和

3、未誘導(dǎo)情況下脂肪體蛋白質(zhì)的表達(dá)譜，獲得家蠶脂肪體與辛硫磷抗性相關(guān)蛋白，結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，鑒定差異表達(dá)蛋白，繼而采用半定量RT-PCR方法研究該蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1辛硫磷對(duì)大造品種5齡3d雌雄家蠶的致死中量測(cè)定
　　 用不同濃度梯度的辛硫磷藥液處理雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)的5齡3d家蠶，分別測(cè)定雌雄家蠶的辛硫磷致死中量，結(jié)果表明，雌性家蠶LC50為3.932~4.184μg/mL，雄性家蠶LC50為3.9

4、89~4.219pg/mL，雄性家蠶的抗性略高于雌性家蠶。為之后的取材工作提供了一定的理論依據(jù)。
　　 2雄性家蠶在有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)下脂肪體蛋白的表達(dá)譜研究
　　 2.15齡3d雄蠶在有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)后脂肪體雙向電泳圖譜的建立
　　 采用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥辛硫磷誘導(dǎo)后的5齡3d雄蠶脂肪體的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，對(duì)照組共檢測(cè)到465個(gè)蛋白點(diǎn)，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到396個(gè)蛋白點(diǎn)，其中能匹配的蛋白點(diǎn)有3

5、48對(duì)，匹配率為73.54％，蛋白點(diǎn)主要分布在分子質(zhì)量20.1~66.4kD、等電點(diǎn)5~8的范圍內(nèi)。
　　 2.25齡3d雄蠶在有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)下脂肪體差異蛋白的質(zhì)譜鑒定
　　 將分析所得到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了基質(zhì)輔助質(zhì)量飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)分析，已鑒定的蛋白包括家蠶磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(SerB)和家蠶甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。這2個(gè)蛋白分別涉及不同的代謝途徑，如絲氨酸生物合成途徑、絲氨酸代謝途徑、糖酵

6、解途徑、糖原異生途徑、核苷酸代謝途徑等。
　　 2.3辛硫磷誘導(dǎo)后5齡3d雄蠶各組織中SerB基因的轉(zhuǎn)錄活性
　　 采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)辛硫磷誘導(dǎo)后5齡3d雄蠶幼蟲(chóng)脂肪體等6種組織器官中SerB基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后，在腦、中腸、絲腺、脂肪體、精巢、馬氏管組織器官中，SerB基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別比對(duì)照組上調(diào)183%、4.48%、9.55%、2.6%、1.88%、15.25%，其中脂肪體中

7、SerB基因的表達(dá)上調(diào)與蛋白的表達(dá)上調(diào)一致。
　　 3雌性家蠶在有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)下脂肪體蛋白的表達(dá)譜研究
　　 3.15齡3d雌蠶在有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)后脂肪體雙向電泳圖譜的建立
　　 采用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥辛硫磷誘導(dǎo)后的5齡3d雌蠶脂肪體的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，對(duì)照組共檢測(cè)到516個(gè)蛋白點(diǎn)，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到457個(gè)蛋白點(diǎn)，其中能匹配的蛋白點(diǎn)有409對(duì)，匹配率為70.25%，蛋白點(diǎn)主要分布在分子質(zhì)

8、量20.1~66.4kDa、等電點(diǎn)5~8的范圍內(nèi)。
　　 3.25齡3d雌蠶在有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)下脂肪體差異蛋白的質(zhì)譜鑒定
　　 將分析所得到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了MALDI-TOFMS分析，已鑒定的蛋白包括家蠶熱休克蛋白/熱激蛋白(HSP)和家蠶磷酸甘油醛異構(gòu)酶/磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI/TIM)。這2個(gè)蛋白分別涉及不同的代謝途徑，如參與糖酵解過(guò)程，調(diào)節(jié)ATP敏感的鉀離子通道，催化丙糖磷酸異構(gòu)體在二羥丙酮磷酸和D型甘油醛-3-

9、磷酸之間轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)糖原異生和糖原生成的作用。
　　 家蠶屬鱗翅目蠶蛾科昆蟲(chóng)，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者對(duì)家蠶的農(nóng)藥抗性進(jìn)行了較多的研究，但從蛋白質(zhì)組水平對(duì)家蠶有機(jī)磷農(nóng)藥抗性的研究較少，篩選出與家蠶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥抗性相關(guān)的蛋白至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究初步鑒定出有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)后家蠶脂肪體的4個(gè)特征蛋白，推測(cè)這些蛋白可能在家蠶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥代謝解毒過(guò)程的某些環(huán)節(jié)中發(fā)揮了一定的作用，本研究結(jié)果對(duì)于研究家蠶對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的