家蠶和野桑蠶對有機磷農藥抗性的研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)和野桑蠶(Bombyx mandarina)具有共同的起源，家蠶的人工馴化歷史已經有5700多年，經過長期的人工選擇，家蠶的產絲性能得到了大幅度的提高，但對環(huán)境的適應性出現了退化的趨勢；野桑蠶長期棲息在野外的桑樹上，經過自然選擇和農藥的壓力選擇，其對野外環(huán)境的抗性，特別是對農藥的抗性表現增強的趨勢。一方面，家蠶由于對農藥的抗性弱，每年都造成大量的農藥中毒現象，有的蠶區(qū)已經放棄秋蠶的飼養(yǎng)；另一方面，野桑蠶由于

2、對農藥的抗性在增強，嚴重危害桑葉的生產，成為制約蠶絲業(yè)健康發(fā)展的一對矛盾。為了比較研究家蠶和野桑蠶對有機磷農藥抗性差異的分子基礎，本文以家蠶品種大造和蘇州系統的野桑蠶為研究材料，比較研究了家蠶和野桑蠶對辛硫磷農藥的敏感性、乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性、兩種類型乙酰膽堿酯酶基因(ace)的結構、ace在農藥誘導下的表達特征及家蠶和野桑蠶的ace2的體外表達產物對毒扁豆堿的敏感性。 以家蠶和野桑蠶的各齡起蠶為實驗材料，采用浸葉法，

3、研究了1～5齡家蠶和野桑蠶對辛硫磷農藥的抗性的差異。結果表明，小蠶期家蠶和野桑蠶對辛硫磷的敏感性差異相對較小，隨著齡期的增大，家蠶和野桑蠶對辛硫磷農藥的敏感性差異較大，野桑蠶4齡LC50為家蠶的4．43倍，5齡為家蠶的4．02倍。 為了研究家蠶和野桑蠶的AChE的活性及毒扁豆堿對其抑制中量(I50)差異，本文以家蠶和野桑蠶2齡起蠶及5齡第3 d的頭、中腸、脂肪體和絲腺為實驗材料，測定了AChE的酶活性和I50。結果表明，野桑蠶2

4、齡起蠶的酶活是家蠶的1．65倍；5齡第3 d野桑蠶和家蠶的頭、中腸、脂肪體和絲腺的酶活之比分別為：1．90倍、2．23倍、2．76倍、2．78倍；毒扁豆堿對家蠶和野桑蠶AChE的I50分別為5．02×10-7M和5．23×10-7M。 構建了野桑蠶腦組織的cDNA文庫，經鑒定文庫的滴度達3．5×105 pfu/mL，文庫插入片段的平均大小為1．2 kb。從文庫的測序結果中獲得野桑蠶化學感受蛋白基因(CSP3)完整的開放閱讀框(登

5、錄號：EU439267)并對其進行了序列分析。結果表明：該基因讀碼框由384個核苷酸組成，編碼127個氨基酸，分子量為14．6 kD。通過對該基因編碼的氨基酸和其它17種昆蟲的CSP編碼的氨基酸進行進化分析，發(fā)現該基因與家蠶的CSP3的同源性最高，達96．85％。該基因的發(fā)現對于研究家蠶和野桑蠶對化學農藥的敏感性具有重要意義。 利用RT-PCR方法，克隆了家蠶乙酰膽堿酯酶基因(Bm-ace1、Bm-ace2)。序列分析表明：Bm

6、-acel的ORF包含堿基2025 bp，編碼683個氨基酸，推導其表達蛋白的分子量為76．955 kD，等電點(pI)為6．36；Bm-ace2的ORF包含堿基1917 bp，編碼638個氨基酸，推導其表達蛋白的分子量為71．675 kD，等電點(pI)為5．49；Bm-ace1和Bm-ace2均具有乙酰膽堿酯酶基因(ace)的特征性區(qū)域。進化分析表明：Bm-ace1(ABY50088)和來源于中國野桑蠶的Bmm-ace1(ABM66

7、370)的同源性最高，達99．71％，Bm-ace2(ABY50089)和來源于中國家蠶的Bm-ace2(NP001037366)的同源關系最近，為99．84％。依據家蠶基因組信息，將Bm-acel和Bm-ace2分別定位于第15號和第9號染色體，為深入研究家蠶對有機磷農藥的抗性機制打下基礎。 為了進一步研究野桑蠶和家蠶對辛硫磷農藥的抗性差異的分子基礎，采用了RT-PCR、RACE方法，克隆了野桑蠶兩種AChE基因的cDNA全長

8、，命名為Bmm-ace1和Bmm-ace2，對其進行了序列分析。研究結果表明：Bmm-ace1和家蠶ace1(Bm-ace1)編碼的氨基酸數均為681，同源性達99．71％，存在2個氨基酸的突變(G664S、S307P)，野桑蠶ace2(Brain-ace2)和家蠶ace2(Bin-ace2)編碼的氨基酸數為634，同源性達99．37％，存在4個氨基酸的突變(M18I、N233S、I310V、G621S)。進化分析表明，ace2在物種之

9、間相對保守。分析Bmm-ace1的cDNA5'翻譯序列(5UTR)區(qū)域，與家蠶ace1基因(Bm-ace1)的cDNA5'UTR(242個堿基)相比，Bmm-acel的5'UTR包含有231個堿基，存在2個位點的點突變和一段連續(xù)11個堿基的缺失。通過克隆和測序分析野桑蠶基因組中Bmm-ace1的5'UTR片段，表明野桑蠶和家蠶ace1基因的RNA剪切都遵循GT-AG規(guī)則，但在其cDNA5'UTR的RNA剪接過程中存在差異，野桑蠶在其cD

10、NA上游+33處存在比家蠶少剪接的序列TGATTTGAAGG，而在其基因組中5'UTR的TGATTTGAAGG序列下游一4位點缺失ACAGA序列。研究結果可為深入探討ace1基因和抗藥性的關系提供新的信息。 為了比較研究家蠶和野桑蠶ace1和ace2基因在幼蟲各發(fā)育階段、各組織及其在辛硫磷農藥誘導后的表達特征。本實驗采用了半定量RT-PCR方法，研究了ace1、ace2在野桑蠶和家蠶的1～5齡各發(fā)育階段、5齡第3 d的血淋巴、腦

11、組織、中腸、脂肪體和絲腺各組織的表達特點；并且研究了在不同濃度的辛硫磷添食后的表達特征，并研究了高于致死中量濃度的辛硫磷誘導后，ace1和ace2在各組織的表達特點。發(fā)育表達分析表明，從1齡到5齡家蠶Bm-ace1和Bm-ace2的表達量都表現先下降后上升的趨勢，其中Bm-ace1的最低表達量在3齡、Bm-ace2的最低表達量在2齡，野桑蠶從1齡到5齡Bmm-ace1和Bmm-ace2的表達量都表現逐步下降的趨勢，其中Bmm-ace1的

12、下降趨勢較Bmm-ace2明顯，和家蠶呈現不同的表達特征。組織表達分析表明，ace1只在家蠶和野桑蠶的腦組織和脂肪體中表達，ace2在家蠶和野桑蠶的所研究的組織中都有表達，ace1和ace2在腦組織和脂肪體內過量表達；ace1在家蠶和野桑蠶的腦組織表達量一致，而ace2在野桑蠶的腦組織表達量為家蠶的4．17倍。辛硫磷添食后的表達表明，2齡家蠶和野桑蠶在小于致死中量濃度時，隨著濃度的上升，ace1的表達量都在增加，ace2在家蠶體內有增加

13、的趨勢，但在野桑蠶體內維持較高的表達量，總體表達量在不斷下降；在高于致死中量的辛硫磷誘導下，ace1和ace2的表達量都在減少，但Bmm-ace2的減少量較少。高于致死中量的辛硫磷誘導后的組織表達分析表明，在脂肪體的表達量都存在減少的趨勢，Bmm-ace1、Bm-ace1、Bm-ace2分別減少了82．67％、81．11％、84．50％，Bmm-ace2的表達減少程度較低，只有30．56％。 為了比較研究Bm-ace2和Bmm-

14、ace2基因的表達產物的生物活性及其對農藥代謝的差異，分別將Bm-ace2和Bmm-ace2克隆至桿狀病毒轉移載體pFastBacHTB中獲得pFast-Bm-ace2和pFast-Bmm-ace2，分別將其轉化DH10Bac感受態(tài)細胞后，用PCR方法檢測證實所分離的重組病毒DNA中含有目的片段的基因。用脂質體法轉染家蠶BmN細胞，分別獲得重組病毒。SDS-PAGE和Western Blot分析表明，Bm-ace2和Bmm-ace2均被