鯽魚(yú)乙酰膽堿酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敏感性及有機(jī)磷農(nóng)藥殘留研究.pdf

1、乙酰膽堿酯酶（Acetyl Cholinesterase，AChE）是一種多分子型糖蛋白，存在于生物體內(nèi)神經(jīng)組織、肝臟、肌肉、紅細(xì)胞以及脾臟中，在生物神經(jīng)傳導(dǎo)中起重要作用，其活性受有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥特異性抑制，AChE的活性變化是敏感的農(nóng)藥毒理學(xué)指標(biāo)，可被應(yīng)用于農(nóng)藥的毒性和環(huán)境污染評(píng)價(jià)的生物標(biāo)記物。因而關(guān)于AChE的研究成為環(huán)境、農(nóng)藥、毒理領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。魚(yú)類(lèi)是水生生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphorus pest

2、icides OPs）較敏感的一類(lèi)動(dòng)物，而關(guān)于淡水魚(yú)類(lèi)乙酰膽堿酯酶的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。
　　 本文首次以淡水魚(yú)類(lèi)鯽魚(yú)為對(duì)象，提取其腦、肝臟、肌肉中的AChE并進(jìn)行分離純化，對(duì)其生化性質(zhì)進(jìn)行了研究。進(jìn)而以六種有機(jī)磷農(nóng)藥為抑制劑，探討和評(píng)價(jià)了鯽魚(yú)AChE對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性。建立了兩種有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏和辛硫磷的化學(xué)發(fā)光快速分析方法；建立了鯽魚(yú)中辛硫磷殘留量的高效液相色譜分析法。研究結(jié)論如下：
　　 1．以鯽魚(yú)、兔、雞為AChE酶

3、源，測(cè)定并比較了三種動(dòng)物以及同一動(dòng)物的不同部位的蛋白質(zhì)含量，AChE酶活及對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏的敏感性指標(biāo)IC50。研究結(jié)果為：七種酶源中，鯽魚(yú)腦AChE比酶活最高，達(dá)105.59μmol/min.g，而其IC50值僅為8.168μg/mL，為所篩選酶源中的最低值。故確定鯽魚(yú)為AChE酶源。
　　 2．首次運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法探討了鯽魚(yú)腦、肝臟、肌肉中AChE的提取條件的優(yōu)化組合。研究結(jié)論為：鯽魚(yú)腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶的最佳提取條件

4、為，提取液為pH值為8.0的磷酸鹽緩沖溶液、勻漿比為1：4。在此條件下鯽魚(yú)腦、肝臟和肌肉中AChE的比酶活最高，比酶活力值最大。其AChE比酶活分別為149μmol/min.g，13μmol/min．g和262μmol/min.g。
　　 3．運(yùn)用中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法得鯽魚(yú)腦、肝、肌肉AChE比酶活測(cè)定最佳條件組合為，魚(yú)腦酶活測(cè)定的最佳條件為保溫時(shí)間35min，保溫溫度32℃，pH值7.6。肝臟酶活測(cè)定的最佳條件為保溫時(shí)間

5、28mm，保溫溫度30℃，pH值7.6。肌肉酶活測(cè)定的最佳條件為保溫時(shí)間31min，保溫溫度31℃，pH值7.6。
　　 4．鯽魚(yú)腦、肝、肌肉AChE的生化性質(zhì)參數(shù)及對(duì)六種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)果如下：
　　 4.1鯽魚(yú)腦部、肝臟、肌肉中AChE粗提取液的米氏常數(shù)Km值分別為1.063mmol/L，7.864mmol/L，4.028mmol/L；最大反應(yīng)速度Vmax值分別為52.91mmol/(L.min)，31.

6、746mmol/(L.min)，135.13mmol/(L.min);測(cè)得Km值可知：在有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏抑制條件下，鯽魚(yú)腦部乙酰膽堿酯酶與底物親和力最強(qiáng)，其次是肌肉，肝臟中乙酰膽堿酯酶與底物親和力最弱。
　　 4.2鯽魚(yú)腦部、肝臟、肌肉中AChE粗提取液對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏的雙分子速率常數(shù)Ki值分別為1.011L/(g.min)，0.472L/(g.min)，0.173L/(g.min)。由測(cè)得Ki值可知：對(duì)于有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏的抑

7、制，鯽魚(yú)腦部乙酰膽堿酯酶的敏感性最強(qiáng)，其次是肝臟，肌肉中乙酰膽堿酯酶的敏感性最弱。
　　 4.3通過(guò)測(cè)定鯽魚(yú)腦部、肝臟、肌肉中AChE粗酶液對(duì)六種有機(jī)磷農(nóng)藥的IC50值，分析比較可得以下結(jié)論：
　　 鯽魚(yú)腦部AChE粗酶液對(duì)六種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性由強(qiáng)到弱分別為：敵敵畏＞辛硫磷＞殺螟松＞三唑磷＞樂(lè)果＞倍硫磷。
　　 鯽魚(yú)肝臟AChE粗酶液對(duì)六種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性由強(qiáng)到弱分別為：敵敵畏＞辛硫磷＞殺螟松＞樂(lè)果＞倍硫磷＞

8、三唑磷。
　　 鯽魚(yú)肌肉AChE粗酶液對(duì)六種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性由強(qiáng)到弱分別為：敵敵畏＞三唑磷＞辛硫磷＞殺螟松＞樂(lè)果＞倍硫磷。
　　 4.4六種有機(jī)磷農(nóng)藥和膽堿酯酶強(qiáng)抑制劑毒扁豆堿對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制效應(yīng)比較結(jié)果為：
　　 鯽魚(yú)各部分AChE對(duì)敵敵畏和毒扁豆堿表示出較強(qiáng)的敏感性，抑制曲線隨時(shí)間呈良好的上升趨勢(shì)，而其中肝臟的酶構(gòu)成種類(lèi)復(fù)雜，例如有超氧化物歧化酶(SOD)等，干擾較大，使趨勢(shì)曲線雜亂。
　　 5

9、．對(duì)鯽魚(yú)腦和肝臟AChE進(jìn)行了純化和初步結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，鯽魚(yú)肝臟AChE粗酶液經(jīng)聚乙二醇雙水相萃取，DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析后純化后，純化倍數(shù)達(dá)145倍。
　　 鯽魚(yú)腦AChE粗酶液經(jīng)聚乙二醇雙水相萃取，DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析和Sephadex G-200純化后得到了較純的乙酰膽堿酯酶(AChE)，純化倍數(shù)達(dá)214倍。經(jīng)紫外吸收光譜、紅外光譜和圓二色譜分析證明，鯽魚(yú)腦AC

10、hE純化最終產(chǎn)物具有蛋白質(zhì)和酶的相關(guān)結(jié)構(gòu)特征。
　　 6．建立了鯽魚(yú)AChE為之敏感性高的兩種有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏和辛硫磷在實(shí)際樣品種的化學(xué)發(fā)光快速分析方法，方法評(píng)價(jià)指標(biāo)為：
　　 6.1.在最佳反應(yīng)條件下，辛硫磷濃度在1.0×10-8g/mL-1.0×10-6g/mL范圍內(nèi)時(shí)，△I與辛硫磷濃度成良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=121.43x+95232，相關(guān)系數(shù)r為0.9979，檢出限為5.4×10-9g/mL;敵敵畏濃

11、度在8.0×10-8g/mL-1.0×10-5g/mL范圍內(nèi)時(shí)，△I與敵敵畏濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=2013.7x+13292，相關(guān)系數(shù)為r=0.9997，檢出限為6.0×10-8g/mL。
　　 6.2.采用化學(xué)發(fā)光法和氣相色譜法檢測(cè)實(shí)際樣品（小白菜）中辛硫磷含量，結(jié)果基本吻合；在實(shí)際樣品（大白菜和生菜）中未檢出敵敵畏，向?qū)嶋H樣品中添加己知濃度的敵敵畏做回收率實(shí)驗(yàn)，回收率分別達(dá)124％和115%，達(dá)到了農(nóng)藥殘

12、留分析相關(guān)要求。
　　 6.3.經(jīng)紫外吸收光譜和熒光光譜驗(yàn)證，確定兩種有機(jī)磷農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理為，魯米諾溶液的最大發(fā)射波長(zhǎng)在λmax=420nm處，發(fā)光體是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。向魯米諾中加入H2O2后并沒(méi)有新的發(fā)光物質(zhì)生成，發(fā)光體仍然是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。加入辛硫磷和敵敵畏后體系的最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生改變，說(shuō)明發(fā)光體仍舊是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。
　　 7．建立了鯽魚(yú)體內(nèi)辛硫磷殘