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文檔簡介
1、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑,生物進化的過程中十分保守。在人、小鼠、果蠅等研究中表明TGF-β蛋白是一種多功能的細胞間信號蛋白,在細胞增殖、識別、凋亡、專一性分化及細胞外基質(zhì)合成等方面發(fā)揮重要作用,具有多種生物學效應(yīng)。雖然在果蠅和哺乳動物中TGF-β信號通路研究的比較深入,但是,家蠶作為鱗翅目中一種典型的模式經(jīng)濟昆蟲,關(guān)于TGF-β信號通路的研究還未見報道。本研究在成功克隆家蠶TGF-β信號通路上兩個關(guān)
2、鍵基因Bmdpp和Bmdaw的基礎(chǔ)上,分析了Bmdpp和Bmdaw基因的表達模式及其蛋白在家蠶BmN細胞中的亞細胞定位;研究了不同病原微生物感染家蠶后對Bmdpp和Bmdaw mRNA表達水平的影響;在細胞水平探討了調(diào)節(jié)Bmdpp和Bmdaw表達水平對家蠶核型多角體病毒(BmNPV)和質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)增殖的影響;探究了TGF-β信號通路與Toll、Imd、JAK/STAT和RNAi通路的相關(guān)性;通過Co-IP篩選了BmN細胞
3、中可能與Bmdpp和Bmdaw互作蛋白,并利用質(zhì)譜技術(shù)對蛋白條帶進行了鑒定。期望通過探討家蠶TGF-β信號通路中Bmdpp和Bmdaw基因的功能,明確TGF-β信號通路在家蠶先天免疫途徑中的作用,其研究結(jié)果可為家蠶抗病性研究提供新的思路。本研究取得的主要結(jié)果如下:
1.家蠶TGF-β信號通路Bmdpp和Bmdaw基因的克隆及序列分析
為了研究家蠶 TGF-β信號通路的功能,我們參考果蠅的dpp(序列號:NM_0579
4、63.5)和 daw(序列號:NM_001273038.1)序列,在家蠶數(shù)據(jù)庫(http://www.silkdb.org/silkdb/)中比對獲得了家蠶Bmdpp和Bmdaw基因序列。根據(jù)現(xiàn)有的EST序列設(shè)計了基因特異性引物進行RT-PCR克隆,測序結(jié)果顯示,Bmdpp的ORF為1110 bp,編碼370aa;Bmdaw的ORF為1086 bp,編碼362aa。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析顯示,Bmdpp蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)卷曲和α螺旋;
5、Bmdaw蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)卷曲。Bmdpp和Bmdaw均含有TGF-β蛋白結(jié)構(gòu)域,推測其具有TGF-β蛋白活性,且與果蠅dpp和daw同源性較高。
2.家蠶Bmdpp和Bmdaw基因表達譜分析
為了探討家蠶 Bmdpp和 Bmdaw基因的表達規(guī)律,通過實時定量 PCR(Real-Time PCR)分析了Bmdpp和Bmdaw基因在家蠶五齡第3天不同組織(精巢、卵巢、脂肪體、頭、絲腺、馬氏管、血細胞、中腸和氣管
6、叢)的表達水平。結(jié)果顯示,Bmdpp和Bmdaw基因在血細胞中表達量最高,其它組織中表達量均較低。
3.家蠶Bmdpp和Bmdaw蛋白多克隆抗體制備和亞細胞定位分析
為了分析Bmdpp和Bmdaw細胞定位特征,將Bmdpp和Bmdaw基因分別克隆進原核表達載體pET-28a(+),在E.coli中誘導表達,并利用重組蛋白免疫小鼠,制備了抗Bmdpp和Bmdaw的多克隆抗體。Western blotting實驗證實制備
7、多克隆抗體具特異性。細胞定位結(jié)果顯示,Bmdpp和Bmdaw主要定位在BmN細胞的細胞質(zhì)膜中。
4. Bmdpp和Bmdaw基因?qū)Σ≡⑸锏母腥緫?yīng)答
為了探討B(tài)mdpp和Bmdaw基因?qū)毦筒《靖腥镜拿庖邞?yīng)答,分別利用核型多角體病毒(BmNPV)、質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)和滅活的黑胸敗血芽孢桿菌(Bab)感染家蠶BmN細胞和4齡家蠶(大造);用脂多糖(LPS)刺激家蠶BmN細胞,用滅活的大腸桿菌(E.coli
8、)感染4齡家蠶(大造),按不同時間點分別收集對照組、誘導組的細胞和家蠶組織,提取總RNA,real-time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在家蠶BmN細胞中,LPS、Bab和BmCPV刺激均可下調(diào)Bmdpp基因的表達,提升Bmdaw基因的表達水平;而BmNPV刺激會上調(diào)Bmdpp基因的表達水平,下調(diào)Bmdaw基因的表達。家蠶(大造)幼蟲感染BmNPV48和72 h后,血液中Bmdpp轉(zhuǎn)錄水平分別是對照組的4.4和45.9倍,Bmdaw的表達水平
9、是對照組的0.5和0.02倍;家蠶幼蟲感染BmCPV48后,中腸中的Bmdpp轉(zhuǎn)錄水平迅速提高至對照組的34倍,72后下降到與對照組幾乎一致,而Bmdaw基因的表達水平與對照組無顯著變化。
5.調(diào)節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因表達對BmNPV和BmCPV增殖的影響
為進一步鑒定Bmdpp和Bmdaw基因的功能,根據(jù)基因的序列分別設(shè)計、合成了3條siRNA,轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞沉默Bmdpp和Bmdaw基因。分別將Bmdpp
10、和Bmdaw基因克隆進載體 pIZT/V5-His,轉(zhuǎn)染家蠶 BmN細胞系,分別篩選過表達Bmdpp和Bmdaw基因轉(zhuǎn)化細胞。然后,探討調(diào)節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因表達水平對 BmNPV、BmCPV增殖復制的影響。感染48 h后的real-time的檢測結(jié)果顯示,在過表達Bmdpp基因的轉(zhuǎn)化細胞中,BmNPV和BmCPV的增殖水平有不同程度地下降;在過表達Bmdaw基因的轉(zhuǎn)化細胞中,BmNPV的增殖水平明顯下降,BmCPV的增殖水平卻
11、沒有明顯變化。而沉默 Bmdpp和 Bmdaw基因,可不同程度地提升BmNPV、BmCPV的增殖水平。由此推測Bmdpp和Bmdaw基因的表達可影響病毒在細胞內(nèi)增殖復制。
6. TGF-β信號通路與家蠶其它信號通路相關(guān)性分析
昆蟲體內(nèi)主要存在Toll、Imd、JAK/STAT和RNAi4種病原體信號識別條免疫信號通路,為了探討TGF-β通路對免疫通路可能的調(diào)節(jié)作用,我們分別選取了這4種通路的關(guān)鍵基因(spz、PGRP
12、-LB、PGRP-LE、stat、SOCS2、SOCS6、ago2、drc2),利用real-time PCR技術(shù),檢測在了過表達Bmdpp和Bmdaw基因?qū)γ庖咄逢P(guān)鍵基因表達水平的影響。結(jié)果顯示,過表達 Bmdpp基因,BmSOCS2、BmPGRP-LB的表達水平分別上調(diào)了14和13倍,Bmdcr2基因的表達水平也有較明顯上調(diào)。當過表達 Bmdaw基因時,BmSOCS2基因的表達明水平與對照組相比下降了97,BmSTAT基因的表達明
13、顯也被抑制。
7. Bmdpp和Bmdaw基因相互作用蛋白的篩選與鑒定
為了研究Bmdpp和Bmdaw與家蠶BmN細胞的相互作用蛋白,采用免疫共沉淀技術(shù)從過表達 Bmdpp和 Bmdaw的家蠶 BmN細胞中篩選互作蛋白,然后對與Bmdpp和Bmdaw互作的候選蛋白進行質(zhì)譜鑒定,共鑒定了10種蛋白。信息分析結(jié)果顯示,這些蛋白涉及到信號傳導、細胞增殖分化、離子通道、卵巢發(fā)育、核苷酸降解、免疫應(yīng)答、細胞周期與凋亡等各個方面
14、。
綜上所述,本研究克隆了家蠶TGF-β信號通路中兩個基因Bmdpp和Bmdaw,分析了Bmdpp和Bmdaw基因的主要序列特征和表達模式;明確了Bmdpp和Bmdaw基因?qū)倚Q病原微生物誘導的應(yīng)答反應(yīng);發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因的表達水平可顯著性地影響B(tài)mNPV和BmCPV在細胞中的增殖;免疫共沉淀結(jié)果鑒定了在家蠶BmN細胞中可能與Bmdpp和Bmdaw基因相互作用的蛋白,研究結(jié)果不僅加深了我們對家蠶TGF-β信號通
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