林煙草CBL基因家族成員NsylCBL10的功能分析.pdf

1、類鈣調神經素B亞基CBL(calcineurin B-like protein)是近年來報道的一類植物所獨有的鈣感受器蛋白，在植物響應高鹽、低鉀和干旱等非生物脅迫過程中發(fā)揮了重要作用。CBL基因家族在擬南芥、楊樹和水稻等植物中已有較廣泛的研究，但在煙草中至今未見報道。本研究采用同源克隆的方法從林煙草（Nicotiana sylvestris）中獲得CBL家族基因NsylCBL10，并對該基因的氨基酸序列、基因組序列以及表達特性進行了研究

2、，并通過進一步試驗驗證NsyICBL10參與鹽脅迫信號轉導過程中的作用。主要內容有以下幾個方面:
　　(1)利用同源克隆的策略，從林煙草中獲得基因NsylCBL10(Genbank number: KF667488.1)，該基因CDS序列全長為783 bp，編碼一個由260個氨基酸組成的蛋白質，并且該基因的氨基酸序列與擬南芥AtCB L10和楊樹PtCBL10相似性很高，共同位于系統(tǒng)發(fā)育樹的Ⅰ組中。NsylCBL10基因組序列全長

3、為3857bp，含有8個內含子、9個外顯子。
　　(2)將NsylCBL10蛋白的N端與GFP或DsRed2蛋白進行融合，C端與GFP融合，構建瞬時表達載體pGDG-NsylCBL10、pGDR-NsylCBL10和pCam-NsylCBL10，并注射本生煙，通過激光共聚焦顯微鏡對注射部位的下表皮進行觀察，結果表明NsylCBL10的N端融合熒光蛋白后主要分布于質膜、細胞質和細胞核中，在細胞中分布廣泛。NsylCBL10的C端融合

4、熒光蛋白后主要分布于細胞膜上。
　　(3)利用實時熒光定量PCR技術，對NsylCBL10的組織表達情況進行了分析。發(fā)現(xiàn)NsylCBL10在盛花期林煙草各組織器官中均有表達，其在腋芽中的表達量最高，其次為莖、花瓣、主根、葉和萼片，在側根中的表達量相對較低。
　　(4) NaCI處理時,NsylCBL10表達量在短時間內上調，表明NsyIC BL10可能參與植物響應鹽脅迫的信號轉導過程。低鉀脅迫下，NsylCBL10的表達受抑

5、制，表達量下調，該結果與AtCBL10在低鉀脅迫下的表達情況一致。高溫和干旱脅迫下，NsylCBL10的表達量呈現(xiàn)波動變化趨勢。表明NsylCBL10可能參與高鹽、低鉀、高溫和干旱四種脅迫的信號轉導過程。
　　(5)表型觀察和離子含量測定實驗表明在擬南芥中過表達NsylCBL10不僅能夠恢復擬南芥cbl10鹽敏感表型，并且通過調節(jié)體內根部和地上部的Na+與K+的分布及均衡來提高轉基因擬南芥對高鹽脅迫的耐受能力。
　　(6)獲