非小細(xì)胞肺癌TGF-βⅡ型受體基因突變和表達(dá)研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文非小細(xì)胞肺癌TGFβⅡ型受體基因突變和表達(dá)研究姓名：包陽申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)（胸心外科）指導(dǎo)教師：徐志云20090501第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文抗人TGFBR2細(xì)胞外區(qū)域單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體；細(xì)胞免疫熒光染色一抗同前，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體。結(jié)果：1、在兩株來源于同一GCC母細(xì)胞系的細(xì)胞95D和PG中發(fā)現(xiàn)了TGFBR2一種新的純合截斷突變(c492507del)，并且在其相應(yīng)

2、的肺癌組織中得到證實。另外，在該患者其他組織(肝、腎等)以及其他15例GCC和LCC(大細(xì)胞癌)患者肺癌組織中發(fā)現(xiàn)種系雜合型截斷突變(c492507del)，其突變率分別為2／2GCC和7／13LCC，而在100例其他類型NSCLC(包括腺癌、鱗癌和腺鱗癌)及所有正常對照細(xì)胞和組織中未發(fā)現(xiàn)上述突變。2、正常人胚肺成纖維細(xì)胞HFLI的TGFBR2外顯子RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為717bp和805bp，而突變GCC細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物分別為701bp

3、和805bp；3、Westernblotting顯示HFLl細(xì)胞TGFBR2蛋白為全長，而GCC細(xì)胞為截斷蛋白。細(xì)胞免疫熒光染色顯示突變的TGFBR2蛋白仍能在細(xì)胞膜上表達(dá)。結(jié)論：1、新發(fā)現(xiàn)的TGFBR2截斷突變(c492507del)只存在于GCC細(xì)胞和GCC、LCC組織中，基因突變造成TGFBR2的失活可能在GCC和LCC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。2、缺失16bp的TGFBR2截斷突變沒有影響到mRNA的轉(zhuǎn)錄和剪切，但導(dǎo)致翻譯時提前出

4、現(xiàn)終止密碼子，產(chǎn)生TGFBR2截斷蛋白。3、TGFBR2突變產(chǎn)生的截斷蛋白細(xì)胞外區(qū)完整，發(fā)生改變的跨膜區(qū)并未使蛋白從細(xì)胞表面釋放，蛋白仍能在胞膜上表達(dá)。第二部分TGFBl也截斷突變對TGFB信號傳導(dǎo)通路的影響目的：驗證GCC細(xì)胞的TGFBR2截斷突變在TGFB信號傳導(dǎo)通路失活中起了重要作用。方法：1、突變細(xì)胞對外源性TGFBl刺激的敏感性試驗：(1)生長抑制試驗：用不同濃度(0，O2，l，5ng／m1)的外源性TGFBl刺激突變細(xì)胞，用

5、MTS比色法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)來評價細(xì)胞的生長狀況，確定TGFBl對突變細(xì)胞有無生長抑制效應(yīng)，TGFpl濃度為5ng／ml時細(xì)胞增殖降低40％，認(rèn)為對TGFBl敏感；(2)外源性TGFpl對突變細(xì)胞纖連蛋白(FN)的mRNA表達(dá)的影響：對攜帶有突變的GCC細(xì)胞分別施加TGFpl濃度為0和5ng／nll的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48llr后，用實時定量PCR和△△Ct法檢測TGFp1處理前后FN的mRNA相對表達(dá)量變化，內(nèi)參照基因為GAPDH。2、野