家蠶PcG家族分析及BmRYBP的功能研究.pdf

1、多細(xì)胞有機(jī)體一般起源于單個(gè)細(xì)胞，分化為多種類型的細(xì)胞后，雖然每個(gè)細(xì)胞中都包含相同的遺傳信息，但不同組織的細(xì)胞行使截然不同的功能。細(xì)胞所攜帶信息中僅有約1％的區(qū)域產(chǎn)生蛋白，其余的99％通過DNA的甲基化等作用被抑制，有一群很重要的基因polycombgroup(PcG)維持了生命的這種既定的分子機(jī)制。PcG蛋白是一群對(duì)任何有機(jī)體的生長發(fā)育都很重要的普遍的轉(zhuǎn)錄抑制因子，首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，雖然他們通常在結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)基序上并不相關(guān)，卻由于行使

2、共同的功能而形成一個(gè)家族，在物種間高度保守。果蠅中已有的研究表明，PcG蛋白主要通過形成蛋白復(fù)合體的形式行使功能，目前鑒定的蛋白復(fù)合體形式主要有三種：Polycomb抑制復(fù)合體1(PRC1)、Polycomb抑制復(fù)合體2(PRC2)和Pho抑制復(fù)合體(PhoRC)。近二十年來的研究表明，PcG蛋白不僅調(diào)控了同源異型基因的正確表達(dá)，而且與其他的生命進(jìn)程密切相關(guān)，例如X染色體的失活、細(xì)胞的增殖與分化、干細(xì)胞的全能性和癌癥發(fā)生。新的PcG蛋白

3、抑制因子及調(diào)控機(jī)制的研究已經(jīng)成為發(fā)育生物學(xué)以及表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，鑒定PcG蛋白成員并進(jìn)行功能研究對(duì)于闡明真核生物基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
　　 家蠶是完全變態(tài)昆蟲，是鱗翅目昆蟲的典型代表，蠶的細(xì)胞遺傳、形態(tài)遺傳、連鎖分析等研究曾和果蠅并駕齊驅(qū)，為人類認(rèn)識(shí)生物的遺傳和變異規(guī)律提供了重要的證據(jù)。家蠶也是研究動(dòng)物發(fā)生、分化、生長發(fā)育及調(diào)節(jié)、遺傳和變異的模式生物之一，有關(guān)蠶的發(fā)育生物學(xué)研究一直是昆蟲學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)

4、，闡明家蠶的發(fā)育機(jī)制對(duì)于研究以鱗翅目昆蟲為代表的農(nóng)業(yè)害蟲防治也具有指導(dǎo)意義。本研究基于家蠶全基因組序列和表達(dá)譜數(shù)據(jù)，在基因組水平上對(duì)家蠶PcG家族進(jìn)行鑒定和分析；并基于GAL4/UAS雙元系統(tǒng)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因品系，研究PcG蛋白相關(guān)成員BnRYBP((R)ing and(Y)Y1(B)inding(P)rotein)基因的功能，獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.家蠶Polycomb group家族成員的鑒定及表達(dá)分析
　　 Pc

5、G蛋白參與了幾乎所有生物有機(jī)體的發(fā)育調(diào)控?；诩倚Q全基因組數(shù)據(jù)，首先鑒定家蠶的PcG蛋白成員。根據(jù)果蠅PcG蛋白成員信息，通過生物信息學(xué)方法對(duì)9×家蠶基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行同源檢索，鑒定了家蠶中22個(gè)PcG同源基因，這些成員在家蠶中均無報(bào)道。在PRC1的四個(gè)核心亞基中，PC、PH和PSC三個(gè)成員在果蠅和家蠶間的相似性都比較低；而PRC2的四個(gè)核心亞基中，E(Z)、ESC和SU(Z)12三個(gè)成員在兩物種間都高度保守，推測(cè)這可能與PRC2在轉(zhuǎn)錄抑制

6、方面的古老功能有關(guān)；PhoRC已知的兩個(gè)核心亞基PHO和SFMBT在兩物種間也具有很高的保守性。EST數(shù)據(jù)分析表明，家蠶的22個(gè)PcG蛋白成員中有17個(gè)基因具有ESTs證據(jù)。
　　 基于全基因組芯片數(shù)據(jù)，對(duì)家蠶PcG成員的表達(dá)譜進(jìn)行分析，有18個(gè)基因具有探針序列。對(duì)五齡3天幼蟲組織芯片進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因在至少一個(gè)組織中有表達(dá)信號(hào)。其中PcG招募蛋白成員Dsp1、PRC2成員E(z)和Nurf-55(Caf1)三個(gè)基因在所有

7、組織中均高量表達(dá)；除dSfmbt基因外，其他六個(gè)成員Nurf-55(Caf1)、Esc、E(z)、Sce/dRing、Dsp1和Rbf均在生殖腺中出現(xiàn)最高的表達(dá)量；dSfmbt基因只在頭部、體壁和中腸有較弱表達(dá)。家蠶不同發(fā)育時(shí)期的芯片數(shù)據(jù)分析表明，有11個(gè)基因在至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)有表達(dá)信號(hào)，其中三個(gè)基因Dsp1、E(z)、Nurf-55(Caf1)在所有時(shí)間點(diǎn)均持續(xù)表達(dá)，染色體裝配因子Caf1基因的表達(dá)值最高；Dsp1、E(z)、Nurf-

8、55(Caf1)、Rbf和Rpd3五個(gè)基因在蛾期出現(xiàn)明顯的雌雄差異表達(dá)，雌蛾中的表達(dá)值為雄蛾的兩倍以上，尤其是Rpd3和Rbf的表達(dá)差異最為明顯，從上蔟第8天開始出現(xiàn)雌雄差異并一直延續(xù)到蛾期，在雌中有明顯的表達(dá)信號(hào)，而在雄中幾乎不表達(dá);另外的三個(gè)基因Pho、Sce/dRing和Psc在雌蛾中有微弱表達(dá)。
　　 2.家蠶Ring和RYBP基因的克隆及表達(dá)分析
　　 Ring是PRC1的核心成員之一，是組蛋白H2A泛素化的催

9、化亞基。RYBP是在小鼠中鑒定到的與RING相互作用的蛋白，由于RYBP也與YY1轉(zhuǎn)錄因子相互作用，因此命名為Ringand(Y)Y1(B)inding(P)rotein(RYBP)，RYBP是推斷的PcG蛋白相關(guān)成員，該基因行使轉(zhuǎn)錄抑制作用的具體功能還不清楚。根據(jù)果蠅Ring和RYBP基因的氨基酸序列，檢索家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定到了與Ring和RYBP同源的家蠶基因，分別命名為BmRing和BmRYBP。編號(hào)為BGIBMGA00698

10、5的預(yù)測(cè)基因是Ring的同源基因，位于第17號(hào)染色體nscaf2865上，基因結(jié)構(gòu)分析顯示該基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，編碼377個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為41.8kDa，與其他物種同源基因的多序列比對(duì)顯示出較高的相似性，N端為典型的環(huán)指結(jié)構(gòu)域，C端有尚未被命名的保守的功能結(jié)構(gòu)域。在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中沒有預(yù)測(cè)到RYBP同源序列，通過對(duì)家蠶EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索，電子克隆得到了一條長882nt的序列，ORF為420bp，編碼13

11、9個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量15.4kDa，位于第28號(hào)染色體的nscaf3097上。將家蠶RYBP基因的氨基酸序列與其它昆蟲和人的RYBP/YEAF1，人和鼠的YAF2氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其在N端的鋅指結(jié)構(gòu)域高度保守。
　　 利用半定量RT-PCR手段檢測(cè)了BmRing和BmRYBP基因在家蠶幼蟲五齡3天各組織的表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示，BmRing基因在精巢、卵巢、頭和血液有表達(dá)，在其他組織幾乎沒有表達(dá)，與組織芯片分析結(jié)果

12、基本一致。BmRYBP基因在生殖腺和頭中的表達(dá)量較高，在其它組織表達(dá)量相對(duì)較低。本研究對(duì)BmRing和BmRYBP基因進(jìn)行了克隆，以進(jìn)行下一步的功能研究。
　　 3.家蠶Ring和RYBP的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　 為了進(jìn)一步研究家蠶Ring和RYBP的功能，首先對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行了原核表達(dá)及抗體制備?；趐28載體分別構(gòu)建BmRing和BmRYBP的原核表達(dá)重組質(zhì)粒BmRing/p28和BmRYBP/p28，將重組

13、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)表達(dá)菌株中，通過在不同溫度和時(shí)間條件下的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)形式。最終選擇在37℃，0.2mM濃度的IPTG誘導(dǎo)4h后收集菌體并純化蛋白。純化包涵體得到BmRING和BmRYBP的蛋白，免疫成年健康公兔5次后，取耳部靜脈血，用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)在1：64000以上，收獲血清，純化得到多克隆抗體。
　　 4.利用GAL4/UAS系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)BmRYBP基因的轉(zhuǎn)基因干涉研究

14、r>　　 基于GAL4/UAS基礎(chǔ)載體，構(gòu)建含有BmRYBP基因序列反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac[UAS-RYBPIR SV40,3xp3EGFP]，通過顯微注射家蠶大造品種的早期胚胎，篩選獲得在眼部和神經(jīng)具有熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家蠶，建立UAS-RYBPIR的轉(zhuǎn)基因品系。利用基因組PCR，Southern blot和反向PCR等方法對(duì)UAS-RYBPIR的轉(zhuǎn)基因個(gè)體的拷貝數(shù)目和插入位點(diǎn)進(jìn)行分子水平的檢測(cè)，結(jié)果顯示在UAS-RYB

15、PIR轉(zhuǎn)基因品系的大造基因組中插入了外源基因，piggyBac轉(zhuǎn)座子在不同轉(zhuǎn)基因品系的家蠶基因組中分別發(fā)生了一次轉(zhuǎn)座事件，插入位點(diǎn)分別位于第9、12和22號(hào)染色體上。
　　 紅色熒光標(biāo)記的A4GAL4轉(zhuǎn)基因家蠶與綠色熒光標(biāo)記的UAS-RYBPIR轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行雜交，在具有雙色熒光的雜交后代中以發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA形成dsRNA實(shí)現(xiàn)對(duì)BmRYBP的干涉。利用RT-PCR，定量PCR和western blot等檢測(cè)手段，對(duì)A4GAL4與

16、UAS-RYBPIR的雜交后代進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)檢測(cè)，在具有雙色熒光標(biāo)記的雜交后代A4GAL4/UAS-RYBPIR中，BmRYBP的mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均顯著降低，說明在雜交后代中實(shí)現(xiàn)了對(duì)BmRYBP的特異干涉。轉(zhuǎn)基因RNA干涉抑制BmRYBP表達(dá)，同時(shí)BmRing的mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量也有顯著降低，推測(cè)BmRYBP與PcG蛋白核心元件BmRing之間存在調(diào)控表達(dá)關(guān)系，二者可能以協(xié)同作用的方式調(diào)控家蠶發(fā)育基因的表

17、達(dá)，具體的調(diào)控機(jī)制還需要更深入的研究證實(shí)。
　　 對(duì)雜交后代的表型進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)A4GAL4/UAS-RYBPIR雜交后代，出現(xiàn)了不同的表現(xiàn)型：G1代蠶卵轉(zhuǎn)青后出現(xiàn)少數(shù)死亡的現(xiàn)象；幼蟲生長至五齡，根據(jù)眼部發(fā)熒光情況，篩選具有雙色熒光的G1代轉(zhuǎn)基因個(gè)體，待發(fā)育到蛾期后，觀察到A4GAL4/UAS-RYBPIR成蟲出現(xiàn)小翅表型；對(duì)存活到蛾期的A4GAL4/UAS-RYBPIR轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體進(jìn)行交配制種得到G2代，發(fā)現(xiàn)G2代的產(chǎn)卵量明