GTPase蛋白RSA-14-44的功能研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個錯綜復雜且高度有序的動態(tài)過程，其間生精干細胞經(jīng)過有絲分裂、減數(shù)分裂、核濃縮、細胞變形、激活等眾多復雜的變化，最終發(fā)育、分化成為成熟的精子。這些不同的細胞事件既相對獨立、相互區(qū)別，同時又相互關聯(lián)、相互銜接，整合成為一個系統(tǒng)、高效并且可控的有機整體。為確保種群的繁衍和物種的進化，生命體逐漸發(fā)展出一整套精密、復雜的機制來調節(jié)整個精子發(fā)生過程。其中一個很重要的方面就是依據(jù)不同發(fā)育階段的需要，在時間和空間上對精子發(fā)生相關基因的表達進

2、行嚴密的控制。因此，分離、克隆不同發(fā)育階段的差異表達基因，深入研究它們在精子發(fā)生過程中所發(fā)揮的作用，對于揭示精子發(fā)生機理和促進人類生殖健康均具有重要意義。 在本實驗室的前期工作中，我們利用激光捕獲顯微切割技術(LaserCaptureMicrodissection，LCM)，成功地捕獲了大鼠的初級精母細胞和圓形精子細胞；通過抑制性消減雜交技術(SuppressiveSubstractiveHybridization，SSH)構建

3、圓形精子細胞消減初級精母細胞的消減cDNA文庫(RSA)，并從中篩選出差異表達基因。本研究中所涉及的RSA-14-44/mRSA-14-44就是通過上述篩選所得到的一個新基因，其所對應的原始克隆編號為14-44，因此命名為RSA-14-44。該基因的GenBank登錄號為AY149343；編碼序列長度為582bp，編碼一個由193個氨基酸組成并具有Rho-GTPase保守結構域的蛋白質。 生物信息學分析結果顯示，RSA-14-4

4、4的氨基酸序列與RhoGTPase家族中的RhoAlike亞家族成員高度同源。同時，我們通過體外實驗證實純化的GST-RSA-14-44蛋白具有GTPase活性。因此，確定RSA-14-44是RhoAlike亞家族的一個新成員。 針對RSA-14-44的多組織表達分析結果表明，該基因在大鼠睪丸組織中特異表達。對大鼠睪丸組織的免疫組織化學研究證實，RSA-14-44的表達與精子發(fā)生過程密切相關；主要存在于除精原細胞外的各期生精細胞

5、中，特別是處于第一次減數(shù)分裂末期的初級精母細胞中。 利用生物信息學數(shù)據(jù)庫進行同源序列比對，在小鼠中找到一個RSA-14-44的同源序列基因4930544GllRik(GeneID:67653)。二者所編碼的蛋白質序列高度同源，相似度達95.3％，并且具有相同的睪丸組織表達特異性。因此，我們確認該基因是RSA-14-44的小鼠同源基因，并將其命名為mRSA-14-44。 在前期工作中，我們利用酵母雙雜交技術篩選睪丸組織中可

6、能存在的與RSA-14-44相互作用的蛋白質，結果顯示蛋白酶體的組成蛋白PSMB5與RSA-14-44之間存在相互作用。利用GST-pulldown的方法，我們證實RSA-14-44與PSMB5之間存在相互作用。同時，我們還構建了mRSA-14-44的真核表達質粒，并通過免疫共沉淀實驗驗證了mRSA-14-44與PSMB5之間存在相互作用。 為明確RSA-14-44/mRSA-14-44在精子發(fā)生過程中的生物學功能，我們首先通過

7、免疫熒光觀察RSA-14-44和PSMB5在大鼠精子發(fā)生過程中的表達變化。結果顯示，二者在分離到的各期生精細胞中共定位，包括次級精母細胞、圓形精子細胞、長形精子細胞和成熟的精子；二者的定位與整個精子發(fā)生過程密切相關，隨著發(fā)育階段的不同產(chǎn)生相應的變化。其次，蛋白酶體活性實驗的結果證實在過表達RSA-14-441mRSA-14-44或共表達RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5的情況下，細胞的蛋白酶體活性并未發(fā)生顯著變化。此外

8、，我們還利用高通量篩選平臺對RSA-14-44/mRSA-14-44可能參與的細胞信號傳遞通路進行鑒定。分析結果顯示，除CREB通路外，過表達RSA-14-44/mRSA-14-44對所選定的細胞信號通路并未產(chǎn)生顯著的影響。 為進一步明確RSA-14-44/mRSA-14-44與PSMB5相互作用同RSA-14-44/mRSA-14-44蛋白質結構之間的關系，我們構建了分別針對RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5

9、的突變體蛋白表達質粒，并通過免疫共沉淀和甘油密度梯度分離細胞組分來進行相應研究。免疫共沉淀實驗結果顯示RSA-14-44/mRSA-14-44與PSMB5之間存在的相互作用并不依賴于RSA-14-44/mRSA-14-44的激活；同時也不依賴于RSA-14-44/mRSA-14-44中的效應蛋白結合區(qū)、高可變區(qū)結構；但位于CAAXmotif的190位Cysteine對維持二者間的相互作用至關重要。結構預測顯示RSA-14-44/mRSA

10、-14-44中的C190位點可能存在棕櫚酰化(palmitoylation)修飾。 另一方面，利用甘油密度梯度離心分離不同的細胞組分，分析其中RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5的分布。實驗結果表明細胞中的PSMB5以前體形式合成，其N-terminal包含propeptide結構，需要經(jīng)過自剪切加工移除propeptide，轉變?yōu)槌墒煨问降腜SMB5；二者存在于不同的細胞組分之中，成熟體形式PSMB5與蛋白酶體

11、的另一個非催化亞單位PSMA7共存于沉降系數(shù)較大的細胞組分，前體形式的：PSMB5主要與RSA-14-44/mRSA-14-44共存于沉降系數(shù)較小的細胞組分。 在上述研究的基礎上，我們還進一步探討了RSA-14-44/mRSA-14-44對細胞中PSMB5加工過程的影響。分析結果顯示，在細胞中共表達RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5能夠相應提高其中前體形式和成熟體形式PSMB5的蛋白質水平，但并不影響前體蛋白的