百脈根小GTPase激活蛋白GAPs在根瘤發(fā)育中的功能研究.pdf

1、豆科植物分泌類黃酮誘導(dǎo)根瘤菌合成結(jié)瘤因子是共生結(jié)瘤過程的第一步，百脈根中結(jié)瘤因子受體NFR5與NFR1形成異源二聚體，并且被NFR1磷酸化，NFR5和NFR1直接與結(jié)瘤因子結(jié)合，把信號(hào)傳遞給下游蛋白。ROP類小G蛋白R(shí)OP6與NFR5相互作用，并在根瘤原基和早期根瘤中特異性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究鑒定了三個(gè)ROP類小G蛋白的激活蛋白R(shí)acGAPs，分別為L(zhǎng)jRacGAP1，LjRacGAP2，LjRacGAP3，并驗(yàn)證了它們與ROP6-C

2、A的相互作用?；诖嘶A(chǔ)，本研究對(duì)這三個(gè)RacGAPs進(jìn)行了蛋白互作、表達(dá)分析、亞細(xì)胞定位等研究，結(jié)果如下:
　　1.利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，證明這三個(gè)RacGAPs蛋白都能與ROP6組成型活化突變體相互作用。
　　2.Real-TimePCR的結(jié)果顯示，只有RacGAP2基因在瘤里上調(diào)表達(dá)。構(gòu)建RacGAPsPro∷GUS重組質(zhì)粒，組織化學(xué)染色顯示RacGAP2在根瘤原基、早期根瘤和中期根瘤中有特異性表達(dá)，成熟根瘤僅在維管束中

3、表達(dá)，而RacGAP1和RacGAP3在根瘤中沒有明顯表達(dá)。
　　3.分離鑒定了RacGAP1和RacGAP3的LORE1插入突變體，得到的純合植株并沒有表現(xiàn)出與根瘤共生相關(guān)的表型，認(rèn)為這兩個(gè)基因不參與結(jié)瘤共生。
　　4.煙草葉片細(xì)胞中的BiFC進(jìn)一步驗(yàn)證RacGAP2與ROP6及其組成型活化形式相互作用，并且互作發(fā)生在可能為囊泡的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)上。
　　5.RacGAP2在煙草葉片細(xì)胞中的定位于點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)上，與BiFC實(shí)驗(yàn)觀

4、察到的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)相似。然而當(dāng)其與NFR5共表達(dá)時(shí)，RacGAP2除了原有的小點(diǎn)外，還出現(xiàn)了與NFR5重合的大囊泡;當(dāng)與ROP6共表達(dá)時(shí)，RacGAP2原有的小點(diǎn)消失，出現(xiàn)與ROP6重合的略大的點(diǎn)。此結(jié)果進(jìn)一步表明RacGAP2與NFR5、ROP6的互作與囊泡運(yùn)輸有關(guān)。
　　6.在根中超表達(dá)RacGAP2，超表達(dá)植株和對(duì)照組植株結(jié)瘤數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示沒有顯著差異，根毛形狀、根瘤形態(tài)等也沒有明顯變化。RacGAP2的RNAi植株結(jié)瘤數(shù)增多，