成纖維細胞激活蛋白在燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中的表達及意義.pdf

1、研究背景：成纖維細胞激活蛋白(FAPa)是1986年由國外的學(xué)者Rettig等應(yīng)用單克隆抗體F19（用體外培養(yǎng)的人成纖維細胞免疫小鼠獲得）從人類惡性黑色素瘤細胞株LOX當(dāng)中識別的一種膜結(jié)合糖蛋白，它特異性表達活化的成纖維細胞(FB)膜上，在正常成人靜息的FB上通常不表達或者表達水平很低。提示:FAPa是活化FB表面的標志物，在控制FB生長及胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和上皮性腫瘤的演進過程中可能起一定的作用。
　　 近三十年來，國內(nèi)外有關(guān)

2、FAPa的研究工作逐漸開展，大部分集中在組織器官纖維化和上皮性腫瘤的研究領(lǐng)域。大量的研究報道，F(xiàn)APa在大多數(shù)上皮性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，其作用機制有以下幾種可能:(1)發(fā)揮其酶的功能，直接溶解與其相鄰的細胞外基質(zhì)成分，協(xié)助腫瘤細胞的侵襲和參與腫瘤組織的重塑;(2)解離與基質(zhì)蛋白結(jié)合的生長因子，使之發(fā)揮促生長作用;(3)參與腫瘤微血管的生成。目前FAPa已成為腫瘤治療的新型靶目標，成為腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究的熱點，相關(guān)研究工作正

3、在有序地開展，其中的不足之處仍在不斷改進。
　　 FB作為重要的組織修復(fù)細胞，以活化的形式參與創(chuàng)面修復(fù)的各個階段，在創(chuàng)面修復(fù)過程中起重要的作用。FAPa作為活化FB表面的標志物，目前有關(guān)FAPa在創(chuàng)面修復(fù)與組織重建的研究領(lǐng)域開展較少，目前雖然已經(jīng)明確FAPa在創(chuàng)面修復(fù)的早期階段及后期的瘢痕組織中均有不同程度的表達，但是FAPa在創(chuàng)面修復(fù)過程中的動態(tài)表達特點、生理作用及調(diào)控機制，迄今未見系統(tǒng)的研究和闡明。
　　 研究目的：

4、
　　 1.觀測FAPa在大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中的動態(tài)表達特點。
　　 2.觀測FAPa在成人病理性瘢痕組織中的表達特點。
　　 3.初步探討FAPa在燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中可能的作用。
　　 材料與方法：
　　 1.實驗動物分組:健康成年清潔級Wistar大鼠共48只，雌雄不限，體質(zhì)量200～220g（南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）。按統(tǒng)計學(xué)分組要求，隨機分為對照組和實驗組，對照組6只，實驗組

5、42只。實驗組分為燙傷后6h、12h，1d、3d、7d、14d、21d7個分組，每分組6只。
　　 2.深Ⅱ度燙傷模型的建立與組織獲取:Wistar大鼠燙傷模型借鑒文獻設(shè)計，于實驗前一天背部脫毛，0.3％戊巴比妥鈉(1 ml/kg)腹腔注射麻醉。室溫下，將盛有56ml去離子水，直徑約3.0cm的燒瓶放入恒溫水箱中，加熱至燒瓶內(nèi)的溫度為95℃時取出燒瓶，在溫度為90℃時，輕放在大鼠背部皮膚上15s，造成直徑約3.0cm大小的圓形深

6、Ⅱ度燙傷創(chuàng)面（經(jīng)病理驗證為深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面）。傷后大鼠置室溫25℃環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食，每天更換創(chuàng)面敷料一次。分別在傷后預(yù)定時間斷頭處死，取創(chuàng)面中央處1.0 cm×1.0cm全層皮膚組織，1/2放入4％中性多聚甲醛中固定，用于免疫組織化學(xué)實驗，另1/2組織置于-80℃冰箱保存，用于Western blotting檢測試驗。對照組背部脫毛后直接斷頭處死，取與實驗組大鼠相同部位同等大小皮膚組織進行實驗。
　　 3.病理性瘢痕

7、組織的獲取:選擇南方醫(yī)院燒傷科因四肢深Ⅱ度燙傷后形成病理性瘢痕，需要手術(shù)治療的患者6例（診斷依靠病史及病理檢查，病變局部皮膚無破潰，患者無全身疾?。?，男女各半，年齡18-60歲，瘢痕形成時間10-14個月。在征得病人及其家屬同意后，手術(shù)切除病理性瘢痕的同時，在其周邊取少許正常皮膚組織作對照，標本置于-80℃冰箱保存，用于Western blotting檢測實驗。
　　 4.觀測方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western blot

8、ting技術(shù)對FAPa的表達進行定位和半定量檢測。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，對大鼠燙傷創(chuàng)面FAPa的灰度值行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布、方差齊性。對大鼠燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中不同時間點FAPa的灰度值的統(tǒng)計分析采用one-way ANOVA，進一步多重比較采用SNK-q檢驗;成人病理性瘢痕組織及其周圍正常皮膚組織FAPa灰度值的統(tǒng)計分析，采用配對t檢驗。顯著性檢

9、驗水平a=0.05，當(dāng)P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.免疫組織化學(xué)技術(shù)測得FAPa(+)的成纖維細胞被DAB染成棕色定位在創(chuàng)面真皮血管以及新生血管的血管壁和血管周圍。
　　 2.以β-actin為內(nèi)參，Western blotting技術(shù)測得對照組與實驗組各時間點大鼠背部皮膚組織FAPa的灰度值分別為31.67±3.20，84.67±8.71，106.00±11.75,118.33

10、±13.44,117.33±8.62,140.33±15.92,106.17±15.77,79.83±9.30。實驗組各時間點FAPa的灰度值與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組各時間點FAPa灰度值的總體均數(shù)不全相等，其中12h與1d，1d與3d比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余時間點FAPa的灰度值與相鄰時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.以β-actin為內(nèi)參，Western blotting技術(shù)測得成人正常皮膚組織

11、與病理性瘢痕組織中FAPa的灰度值分別為18.00±7.87，47.17±10.09，實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.FAPa在大鼠正常皮膚組織中也有表達，深Ⅱ度燙傷后6h，F(xiàn)APa的表達量已明顯增多，6h以后FAPa的表達量逐漸增多，并在燙傷后第7d達到高峰，7d后FAPa的表達量逐漸減少，至傷后第21d FAPa仍有較高水平的表達。
　　 2.FAPa在成人正常皮膚與病理性瘢痕