5-Fu誘導(dǎo)大鼠肺損傷修復(fù)過程中Oct3-4表達及意義.pdf

1、肺干細胞(lung stem cells)是指能不斷自我更新并在特定條件下分化為功能性肺組織的細胞。由于肺的上皮結(jié)構(gòu)和細胞組成非常復(fù)雜，其細胞種類多達40余種，加上呼吸道上皮具有極低的生長更新率和十分有限的再生能力，導(dǎo)致對肺干細胞的研究進展不如其它組織。但是在肺損傷后干細胞分裂加速，通過不對稱分裂的方式產(chǎn)生子代干細胞及各個組織細胞的祖細胞，最終產(chǎn)生終末分化的細胞以補充受損的細胞，起到促進創(chuàng)傷修復(fù)的作用。
　　 近年來人們相繼發(fā)現(xiàn)

2、多種細胞在發(fā)育過程中表現(xiàn)出肺干細胞特性并在肺損傷修復(fù)中發(fā)揮作用，但是根據(jù)干細胞定義，很多這類細胞屬于祖細胞的范疇，而不是真正意義上的肺干細胞。
　　 我們實驗室曾首次建立了5-Fu引發(fā)離體氣管損傷修復(fù)模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-Fu作用后，增殖期氣管上皮細胞變性、壞死，而殘留在基底膜上的G0期細胞出現(xiàn)胚胎干細胞相關(guān)基因Oct3/4、Sox2、Nanog表達，當G0期細胞出現(xiàn)向基底細胞、纖毛細胞、粘液細胞分化后，Oct3/4、Sox2、Nan

3、og表達消失。研究證明Oct3/4、Sox2、Nanog陽性細胞為氣管干細胞。但5-Fu對遠端肺上皮損傷修復(fù)過程中胚胎干細胞相關(guān)基因Oct3/4變化如何，目前尚無報告。
　　 目的:
　　 本研究通過制備5-Fu誘導(dǎo)肺遠端上皮粘膜損傷模型，觀察其損傷修復(fù)過程中的Oct3/4動態(tài)變化，為鑒定、分離遠端肺上皮干細胞提供新的依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 一、標本收集
　　 雌雄不限Wistar大鼠(

4、～200g)購于中國醫(yī)科大學(xué)動物部25只，隨機分成實驗組和對照組，實驗組：5-Fu損傷后12h組，24h組，48h組，72h組，每組5只，對照組：未經(jīng)5-Fu處理，共5只。乙醚麻醉后將大鼠固定在支架，行氣管插管至氣管分叉處，利用0.9％生理鹽水將5-Fu配制成5mg/mL，按1Omg/Kg劑量灌注大鼠肺內(nèi)，對照組注射等劑量的PBS。分別在灌注12h，24h，48h，72h后處死大鼠取新鮮肺部組織。
　　 A549細胞系來源于中國

5、醫(yī)科大學(xué)病理教研室。
　　 二、實驗方法
　　 將各個時間點的鼠肺組織及正常鼠肺組織收集，一部分用于石蠟包埋切片后行HE染色、間接免疫熒光染色，確定組織損傷后的修復(fù)情況及Oct3/4表達情況，并用雙重免疫熒光染色觀察Oct3/4核陽性細胞和SP-C、CCSP雙陽性細胞的關(guān)系。將另一部分肺組織收集，進行western-blot檢測，觀察Oct3/4蛋白表達情況。
　　 在肺癌細胞系A(chǔ)549中，本課題組已經(jīng)通過體外藥

6、物敏感實驗，得到5-Fu最佳作用濃度為3μl/m1。肺腺癌細胞按5×105/mL密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)的肺腺癌細胞分為兩組：一組是沒有藥物作用的肺腺癌細胞；另一組是經(jīng)過5-Fu作用后的肺腺癌細胞，分別進行免疫熒光染色和western-blot檢測，觀察Oct3/4的表達情況。
　　 所有的免疫熒光實驗和蛋白印跡實驗均獨立重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)的值用均數(shù)(means)±標準偏差(SD)來表示。全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5軟件

7、對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，當P＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、5-Fu誘導(dǎo)大鼠肺損傷修復(fù)過程中遠端肺上皮細胞改變及Oct3/4的表達變化
　　 正常大鼠肺組織在經(jīng)5-Fu打擊12小時后，出現(xiàn)終末細支氣管、肺泡上皮細胞變性、壞死，上皮細胞減少，開始出現(xiàn)Oct3/4核陽性表達，24h后終末細支氣管、肺泡上皮只剩殘留的少量細胞，Oct3/4核陽性表達增多，達到高峰，48h、72h后，終末細支氣

8、管、肺泡上皮逐漸修復(fù)，恢復(fù)原有肺泡結(jié)構(gòu)形態(tài)，Oct3/4核陽性表達逐漸減少。正常終末細支氣管、肺泡上皮未檢測到Oct3/4表達，上皮細胞結(jié)構(gòu)正常。
　　 二、蛋白印跡檢測大鼠肺泡上皮損傷修復(fù)過程中Oct3/4蛋白表達水平
　　 正常終末細支氣管、肺泡上皮沒有Oct3/4表達。5-Fu打擊后12h，出現(xiàn)Oct3/4表達，在24h達到高峰，并隨著終末細支氣管、肺泡上皮細胞的修復(fù)逐漸增加，Oct3/4隨后逐漸降低，至72h降至

9、正常水平。
　　 三、肺組織Oct3/4核陽性表達位置和SP-C(+)、CCSP(+)雙陽性細胞位置不同。
　　 在5-Fu誘導(dǎo)后Oct3/4核陽性表達最多的時間點，進行雙重免疫熒光染色。結(jié)果顯示Oct3/4核陽性的位置和SP-C、CCSP雙陽性細胞處于不同位置。
　　 四、間接免疫熒光及蛋白印跡檢查檢測5-Fu誘導(dǎo)肺腺癌細胞系A(chǔ)549中Oct3/4表達
　　 未經(jīng)5-Fu處理的肺腺癌A549細胞系Oct

10、3/4核表達陰性，經(jīng)5-Fu處理組的A549細胞系出現(xiàn)Oct3/4核陽性表達。
　　 結(jié)論:
　　 1、5-Fu作用前后，終末細支氣管、肺泡上皮細胞出現(xiàn)Oct3/4陽性表達有規(guī)律的消長，正常終末細支氣管、肺泡上皮細胞胚胎干細胞相關(guān)基因Oct3/4陰性，當5-Fu作用后，基底膜殘留GO期細胞出現(xiàn)Oct3/4表達，并短暫增生，在向Clara細胞、纖毛細胞及Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮細胞分化時，Oct3/4再次轉(zhuǎn)陰性。