cDDP、5-FU誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生過(guò)程中細(xì)胞株BGC-823、LoVo的hMSH2、hMLH1表達(dá)變化.pdf

1、目的：胃癌、大腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤。二者在臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期階段，手術(shù)后常有轉(zhuǎn)移，因此，化療成為必要的治療手段。然而，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性影響了化療的治療效果。盡管近年對(duì)腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究很多，但由于腫瘤耐藥性發(fā)生的機(jī)制不清楚，故到目前為止尚無(wú)令人振奮的成果出現(xiàn)。目前認(rèn)為腫瘤耐藥性產(chǎn)生的直接機(jī)制是腫瘤細(xì)胞中一些與抵抗藥物有關(guān)的蛋白表達(dá)增強(qiáng)。這些蛋白或能將化療藥物排出細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度下降以致不能發(fā)揮殺傷作用，或能

2、降低藥物毒性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了十余種這類蛋白，包括：P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)等，它們?cè)诓煌[瘤及腫瘤對(duì)不同化療藥物的耐藥產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮作用。然而，較少有人研究腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生及上調(diào)這些蛋白表達(dá)的機(jī)制。同正常細(xì)胞特別是不穩(wěn)定細(xì)胞一樣，腫瘤細(xì)胞也需要基因修復(fù)系統(tǒng)，以修復(fù)各種原因引起的基因損傷。錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch Repair，MMR)系統(tǒng)就是其中之一，它

3、可以糾正DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的堿基錯(cuò)配，維持基因組穩(wěn)定。該系統(tǒng)功能喪失時(shí)，DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的錯(cuò)配得不到修復(fù)，基因組突變聚積，易變性增加，致使基因表達(dá)紊亂。這是胃癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌等一些不穩(wěn)定細(xì)胞來(lái)源惡性腫瘤發(fā)生的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥性產(chǎn)生過(guò)程中也常伴有MMR系統(tǒng)功能異常。那么腫瘤耐藥性產(chǎn)生是否與MMR系統(tǒng)功能缺失引起的基因不穩(wěn)定性所導(dǎo)致的耐藥相關(guān)基因表達(dá)紊亂有關(guān)呢?本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株BGC-823、大腸癌細(xì)胞株LoV

4、o在順鉑(cDDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生過(guò)程中耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π和錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1的表達(dá)變化，分析二者表達(dá)的關(guān)系，探討胃腸道癌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制。 方法：1．胃癌耐藥細(xì)胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU及大腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU的建立和它們耐藥指數(shù)的測(cè)定：①采用小劑量、逐步遞增cDDP濃度，間歇作用體外誘導(dǎo)法，建立胃癌耐藥細(xì)胞株BGC-8

5、23/cDDP：采用大劑量沖擊，逐步遞增5-FU濃度，間歇作用體外誘導(dǎo)法，建立胃癌耐藥細(xì)胞株BGC-823/5-FU；采用5-FU大劑量間斷沖擊法，建立大腸癌耐藥細(xì)胞株LoVO/5-FU。②用MTT法檢測(cè)耐藥細(xì)胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU、LoVo/5-FU的耐藥指數(shù)。2.耐藥蛋白表達(dá)的檢測(cè)：用免疫細(xì)胞化學(xué)法和W娓stem·blot法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株BGC-823及其耐藥細(xì)胞株BGC-823/eDDP、BGC-8

6、23/5-FU和大腸癌細(xì)胞株LoVo及其耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU的耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π表達(dá)情況，比較親本株與耐藥株這些蛋白表達(dá)的差異。3.錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)的檢測(cè)：用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株BGC-823及其耐藥細(xì)胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU和大腸癌細(xì)胞株LoVo及其耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU的錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1表達(dá)情況，比較親本株與耐藥株這兩個(gè)蛋白表達(dá)的差異。

7、 結(jié)果：1．耐藥細(xì)胞株及其耐藥指數(shù)：①歷時(shí)約8個(gè)月耐藥培養(yǎng)，獲得胃癌耐藥細(xì)胞株BGC-823/cDDP，其對(duì)cDDP的耐藥指數(shù)為3.93。②歷時(shí)約4個(gè)月耐藥培養(yǎng)，獲得胃癌耐藥細(xì)胞株BGC-823/5-FU，其對(duì)5-FU的耐藥指數(shù)為8.21。③歷時(shí)約4個(gè)月耐藥培養(yǎng)，獲得大腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU，其對(duì)5-FU的耐藥指數(shù)為10.26。2.耐藥蛋白表達(dá)：①胃癌細(xì)胞株BGC-823與其耐藥株BGC-823/cDDP：免疫細(xì)胞化學(xué)法

8、檢測(cè)示耐藥蛋白LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達(dá)，但在耐藥株的表達(dá)明顯強(qiáng)于親本株。②胃癌細(xì)胞株BGC-823與其耐藥株BGC-823/5-FU：免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)示耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達(dá)，但在耐藥株的表達(dá)明顯強(qiáng)于親本株；Western·blot法檢測(cè)示耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達(dá)，但耐藥株明顯強(qiáng)于親本株。③大腸癌細(xì)胞株LoVo與其耐藥株LoVo

9、/5-FU：免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)示耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達(dá)，但在耐藥株的表達(dá)明顯強(qiáng)于親本株；Western-blot法檢測(cè)示耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達(dá)，但耐藥株明顯強(qiáng)于親本株。3.錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)：①胃癌細(xì)胞株BGC-823與其耐藥株BGC-823/cDDP：免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)示錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1在親本株與耐藥株均有表達(dá)，但hMSH2表達(dá)

10、在耐藥株明顯弱于親本株，而hMLH1表達(dá)在親本株和耐藥株間未見(jiàn)明顯差異。②胃癌細(xì)胞株BGC-823與其耐藥株BGC-823/5-FU：免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)示錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1在親本株與耐藥株均有表達(dá)，但hMSH2表達(dá)在耐藥株明顯弱于親本株，而hMLH1表達(dá)在親本株和耐藥株間未見(jiàn)明顯差異。③大腸癌細(xì)胞株LoVo及其耐藥株LoVo/5-FU：免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)示錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1在親本株與耐藥株均有表達(dá)，但hM

11、SH2表達(dá)在耐藥株明顯弱于親本株，而hMLH1表達(dá)在親本株和耐藥株間未見(jiàn)明顯差異。細(xì)胞株BGC-823、LoVo耐藥產(chǎn)生后，錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)呈相同模式。 結(jié)論：1.化療藥物作用前，胃癌、大腸癌細(xì)胞株BGC-823、LoVo已有P-gP、MRP、L,RP、GST-π的表達(dá)，表明P-gP、MRP、LRP、GST-π與消化道腫瘤原發(fā)耐藥性有關(guān)。2．胃癌細(xì)胞對(duì)cDDP產(chǎn)生耐藥的機(jī)制可能是LRP、GST-π蛋白的表達(dá)。3．胃癌、大腸癌細(xì)胞