非甾體類抗炎藥對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823COX-2、錯(cuò)配修復(fù)酶hMLH1和hMSH2蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：在我國(guó)，胃癌是嚴(yán)重威脅人民生命健康的疾病。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，錯(cuò)配修復(fù)酶(Mismatchrepairenzyme，MMR)表達(dá)缺失與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。MMR是DNA修復(fù)系統(tǒng)中重要的工具酶，其功能主要是修復(fù)錯(cuò)誤配對(duì)的堿基。MRR超家族有9種錯(cuò)配修復(fù)酶，其中以人類mut-s同系物1(humanmut-lhomologue1，hMLH1)和人類mut-s同系物2(humanmut-shomologue2，hMSH2)功能最重要，二者在很多腫瘤中

2、出現(xiàn)表達(dá)缺失或降低。當(dāng)MRR表達(dá)缺失或降低時(shí)常出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatelliteinstability,MSI)，MSI可使整個(gè)基因組穩(wěn)定性下降，隨機(jī)突變率增高，導(dǎo)致一系列腫瘤相關(guān)靶基因改變，引起腫瘤的發(fā)生。 環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)是合成前列腺素的限速酶，正常組織不表達(dá)，但在消化道腫瘤中常為陽(yáng)性表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。有研究表明，COX-2表達(dá)上調(diào)或活性增加與胃癌形成有關(guān)。P38

3、絲裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activatedproteinkinase，P38MAPK)通路是發(fā)現(xiàn)的一類新的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，P38MAPK表達(dá)和活性的變化可有效調(diào)節(jié)該信號(hào)通路，通過(guò)不同的靶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)，從而介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，參與對(duì)COX-2的調(diào)控，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 非甾體類抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatorydrugs,NSAIDs)對(duì)許多惡性腫瘤具有抑制作用。存在M

4、SI、錯(cuò)配修復(fù)酶缺乏的胃癌細(xì)胞株經(jīng)sulindac(COX-2選擇性抑制劑)處理后，MSI表型減少，提示NSAIDs可通過(guò)減少M(fèi)SI，發(fā)揮抗腫瘤作用。 本研究采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Westernblot等方法研究分析，非甾體類抗炎藥對(duì)體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株COX-2、hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)的影響，以期探討NSAIDs的作用機(jī)制及COX-2、hMLH1、hMSH2與胃癌發(fā)生的關(guān)系。 材料與方法1材料CO

5、X-2高表達(dá)人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823，COX-2選擇性抑制劑：celecoxib；COX-2非選擇性抑制劑：aspirin。 2方法2.1甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定各組BGC-823細(xì)胞株的增殖情況，以確定半數(shù)抑制濃度(IC50)。 2.1.1正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、藥物實(shí)驗(yàn)組；藥物濃度：aspirin100μmol.L-1、200μmol.L-1、400μmol.L-1、800μmol.L-1；celecoxib

6、20μmol.L-1、40μmol.L-1、80μmol.L-1、160μmol.L-1。 2.1.2分別于藥物作用72h后測(cè)定IOD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，根據(jù)IC50=Lg-1[Xm-I(∑p-0.5)]，確定IC50(aspirin400μmol.L-1，celecoxib80μmol.L-1)。 2.2分別選取兩種藥物的三個(gè)不同濃度，aspirin：100μmol.L-1、200μmol.L-1、400μmol.

7、L-1；celecoxib：20μmol.L-1、40μmol.L-1、80μmol.L-1作用于BGC-823細(xì)胞株72h，收集細(xì)胞。 2.3選取aspirinIC50、celecoxibIC50濃度的藥物作用于BGC-823細(xì)胞24h、48h、72h收集細(xì)胞。 2.4檢測(cè)指標(biāo)：2.4.1流式細(xì)胞定量檢測(cè)技術(shù)(FCM)檢測(cè)藥物作用72h細(xì)胞凋亡率的變化。 2.4.2瓊脂糖凝膠電泳(DNALadder)檢測(cè)藥物作

8、用72h細(xì)胞BGC-823細(xì)胞凋亡情況。 2.4.3免疫細(xì)胞化學(xué)法(SP法)觀察藥物作用72h細(xì)胞hMLH1、hMSH2、COX-2蛋白表達(dá)情況的變化。 2.4.4蛋白免疫印跡(WesternBlot)檢測(cè)藥物作用24h、48h、72h細(xì)胞hMLH1、hMSH2、COX-2蛋白的表達(dá)情況。 2.4.5流式細(xì)胞定量檢測(cè)技術(shù)(FCM)檢測(cè)藥物作用24h、48h、72h，細(xì)胞周期及hMLH1、hMSH2、COX-2、p

9、38蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果1Aspirin、celecoxib對(duì)BGC-823細(xì)胞株增殖的影響NSAIDs可抑制BGC-823細(xì)胞增殖，溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化。(P＞0.05，Table1)。aspirinIC50為400μmol.L-1，celecoxibIC50為80μmol.L-1。 2對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡的影響：2.1藥物實(shí)驗(yàn)組BGC-823細(xì)胞DNA直方圖二倍體峰前均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞特征性的亞二

10、倍體峰(Fig.1-3)，對(duì)照組未見(jiàn)凋亡峰。celecoxib組凋亡率(31.50±8.91％)明顯高于aspirin組凋亡率(20.20±6.72％)和對(duì)照組(P＜0.05)。提示NSAIDs可促進(jìn)胃癌細(xì)胞株凋亡，celecoxib在相同條件下誘發(fā)BGC-823細(xì)胞凋亡，效果強(qiáng)于aspirin。 2.2DNALadder的檢測(cè)DNA裂解片段分析，結(jié)果顯示(Fig.4):aspirin400μmol.L-1、celecoxib8

11、0μmol.L-1作用于BGC-823細(xì)胞株，DNA裂解，瓊脂糖凝膠電泳后，上樣孔下方出現(xiàn)較清晰明亮的DNA梯狀條帶?？瞻讓?duì)照組、celecoxib20μmol.L-1、aspirin100μmol.L-1未見(jiàn)DNA梯帶；celecoxib40μmol.L-1、aspirin200μmol.L-1有DNA“涂抹”(smear)現(xiàn)象，并隱約可見(jiàn)模糊的DNA梯狀帶。DNA梯狀分布圖形顯示DNA結(jié)構(gòu)呈有序斷裂，BGC-823細(xì)胞凋亡，從DNA

12、分子水平證實(shí)aspirin、celecoxib作用的BGC-823細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。 3免疫細(xì)胞化學(xué)染色COX-2、hMLH1及hMSH2三者均為核著色，(Fig.6-14)光鏡下觀察，aspirin、celecoxib作用后，COX-2蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較均降低，hMLH1蛋白及hMSH2蛋白表達(dá)均增多。celecoxib作用強(qiáng)于aspirin。 4WesternBlot檢測(cè)COX-2、hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)COX

13、-2蛋白分子量為72kD，Western雜交后在72kD位置出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，hMLH1蛋白分子量為85kD，Western雜交后在85kD位置出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，hMSH2蛋白分子量為110kD，Western雜交后在110kD位置出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。隨著NSAIDs作用時(shí)間延長(zhǎng)COX-2蛋白表達(dá)量逐漸減少，hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)量逐漸增高，且不同作用時(shí)間細(xì)胞的蛋白表達(dá)量均有差異(P＜0.05，F(xiàn)ig.15-17)。)。celecoxib組作

14、用強(qiáng)于aspirin組，兩者與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。 5NSAIDs對(duì)體外培養(yǎng)BGC-823細(xì)胞周期的影響。隨著aspirin、celecoxib藥物濃度的增加，BGC-823細(xì)胞在細(xì)胞周期中的分布發(fā)生變化，G0/G1期細(xì)胞數(shù)逐漸增加，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)逐漸減少。藥物組與asprin組及對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05，table2)。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，G0/G1期細(xì)胞數(shù)逐漸增加，S期和G2/

15、M期細(xì)胞數(shù)逐漸減少。celecoxib組作用強(qiáng)于aspirin組，兩者與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05，table3)。由此可見(jiàn)，aspirin、celecoxib可以將BGC-823細(xì)胞阻滯于G0/G1期，且有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。 6COX-2、hMLH1、hMSH2、和p38蛋白檢測(cè)隨著藥物濃度的增加，COX-2蛋白表達(dá)明顯減少，hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)逐漸增加。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2蛋白表達(dá)逐漸減

16、少，hMLH1、hMSH2、p38蛋白表達(dá)逐漸增加。celecoxib組作用強(qiáng)于aspirin組，兩者與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05，table4-5)。由此可見(jiàn)，aspirin、celecoxib可以影響COX-2、hMLH1、hMSH2、p38蛋白的表達(dá)量，且有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。 結(jié)論1非甾體類抗炎藥的作用：(1)抑制BGC-823細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡。(2)延長(zhǎng)細(xì)胞周期。(3)下調(diào)COX-