肺纖維化過程中肌成纖維細胞活化的調(diào)控機制及干預(yù)研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肺纖維化特征性表現(xiàn)為進行性細胞外基質(zhì)沉積，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺功能逐步喪失。肌成纖維細胞活化是肺纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，標志性的高表達有α-平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)的肌成纖維細胞主要通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)和原位成纖維細胞的激活與轉(zhuǎn)化兩種方式來源，因而將肌成纖維細胞作為治療靶點，阻斷其活化過程，有

2、望成為治療纖維化疾病的新策略。本論文也將圍繞肌成纖維細胞的活化及調(diào)控機制展開，分別從上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和原位成纖維細胞的轉(zhuǎn)化兩個角度進行研究。
　　研究發(fā)現(xiàn)白細胞介素(inerleukin，IL)-22在諸多肺部病理生理過程中發(fā)揮作用，并且可靶向作用于肺泡上皮細胞，故本研究第一部分旨在探討IL-22在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型中的變化與作用，以及對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制。
　　酪氨酸激酶拮抗劑AP24534對c-Abels

3、on tyrosine kinase(c-Abl)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1、血小板源性生長因子(platelet-derivedgrowth factor，PDGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的酪氨酸受體的活性有廣泛的抑制

4、作用，且有證據(jù)顯示以上因子可參與肺纖維化的發(fā)生。故本研究第二部分旨在探討新型制劑AP24534在肌成纖維細胞活化中的干預(yù)作用及調(diào)控機制。
　　研究方法:
　　1)本研究第一部分體內(nèi)實驗采用小劑量博來霉素氣管內(nèi)單次注射誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型，通過組織病理學觀察肺纖維化的程度，通過Western印跡和實時定量PCR檢測上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)指標的變化，以及IL-22的表達變化;原代分離培養(yǎng)小鼠肺組織和脾臟淋巴細胞，通過流式分析技術(shù)檢

5、測IL-22表達細胞在肺纖維化小鼠肺組織和脾臟中的水平;外源性給予人肺泡上皮細胞系A(chǔ)549細胞重組IL-22處理，采用Western印跡檢測α-SMA的表達變化，通過CCK-8法檢測細胞增殖水平;采用抗IL-22中和抗體腹腔內(nèi)注射肺纖維化小鼠，通過組織病理學觀察肺纖維化的程度，研究通過Western印跡和實時定量PCR檢測上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)指標的變化，以及TGF-β和Smad2的磷酸化水平;
　　2)本研究的第二部分采用重組TGF

6、-β1處理小鼠成纖維細胞系NIH/3T3細胞建立成纖維細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的體外細胞模型;給予NIH/3T3成纖維細胞AP24534預(yù)處理，再給予TGF-β1誘導(dǎo)，通過Western印跡或?qū)崟r定量PCR檢測Ⅰ型膠原，α-SMA，Vimentin和金屬蛋白酶MMP9的表達變化;通過siRNA干擾技術(shù)阻斷c-Abl在成纖維細胞中的表達，再通過同樣方法給予TGF-β1處理，檢測上述纖維化相關(guān)指標的變化;通過Western印跡或免疫熒光的方法

7、檢測AP24534對TGF-β1誘導(dǎo)的Smad通路，JNK通路和AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白及其磷酸化的水平的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠在造模后的1～8周呈現(xiàn)出進行性的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，伴有肺組織中IL-22的水平的下降，于第3周最為顯著;肺纖維化小鼠肺部和脾臟中的表達IL-22的γδT細胞水平在第3周時明顯低于對照小鼠;體外采用重組IL-22處理A549細胞可以緩解博來霉素誘導(dǎo)的EMT

8、，表現(xiàn)為EMT的標志物α-SMA的過表達被抑制，同時可部分逆轉(zhuǎn)博來霉素誘導(dǎo)的上皮細胞增殖能力的下降;體內(nèi)實驗采用抗IL-22中和抗體腹腔注射肺纖維化小鼠，可明顯加重肺纖維化的程度:H&E及Masson's三色染色顯示肺泡結(jié)構(gòu)的破壞及細胞外基質(zhì)沉積的加重，Ⅰ/Ⅲ型膠原，α-SMA和金屬蛋白酶MMP9的表達也增加，同時TGF-βmRNA和蛋白水平及Smad2磷酸化水平進一步上調(diào)。
　　2)采用TGF-β1刺激NIH/3T3細胞能夠明顯

9、誘導(dǎo)NIH/3T3成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，主要表現(xiàn)為肌成纖維細胞標志物α-SMA，以及Vimentin，Ⅰ型膠原和金屬蛋白酶MMP9表達上調(diào)，而給予NIH/3T3細胞AP24534預(yù)處理可以明顯抑制由TGF-β1誘導(dǎo)肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，AP24534預(yù)處理能夠阻斷由TGF-β1誘導(dǎo)的c-Abl的活化，而通過基因敲除c-Abl也可阻斷由TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化;以AP24534處理NIH/3T3細胞可抑制由TGF-β1誘導(dǎo)

10、AKT，mTOR(mammaliantarget of rapamycin)和核糖體蛋白S6激酶(S6 ribosomal protein，S6)的磷酸化，但不能抑制Smad3的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，以及JNK和c-Jun的磷酸化。
　　研究結(jié)論:
　　1)本研究第一部分結(jié)果提示IL-22在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中起保護作用，通過干預(yù)TGF-β/Smad通路來抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程進行調(diào)控的，提示了IL-22在肺纖維化中的治療作