β3-AR對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞纖維化作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　使用AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞纖維化，應(yīng)用攜帶β3-AR基因片段的慢病毒感染、β3-AR激動劑及拮抗劑的方法對心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察β3-AR對心肌成纖維細(xì)胞纖維化的影響，探討β3-AR與TGF-β/Smad信號通路對心肌成纖維細(xì)胞纖維化的作用，證明β3-AR激活后可能通過TGF-β/Smad信號通路介導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞纖維化，促進(jìn)心肌重構(gòu)。
　　方法：
　　使用差速貼壁法分離培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞，分別用

2、攜帶β3-AR基因片段的慢病毒感染、β3-AR激動劑及拮抗劑干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞，流式儀檢測心肌成纖維細(xì)胞的最佳慢病毒感染率，篩選出慢病毒對心肌成纖維細(xì)胞的最適感染復(fù)數(shù)。用膜蛋白試劑盒提取心肌成纖維細(xì)胞β3-AR膜蛋白，普通試劑盒提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，Western blot法檢測各樣品中β3-AR蛋白的特異性，分別觀察慢病毒感染和β3-AR激動劑拮抗劑誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中β3-AR及纖維化相關(guān)因子的表達(dá)水平及其相關(guān)性。We

3、stern blot和qRT-PCR檢測各組TGF-β/Smad信號通路及纖維化相關(guān)因子COL-I、COL-Ⅲ蛋白表達(dá)和mRNA的水平。WST-1法檢測各組心肌成纖維細(xì)胞增殖情況。實驗分組1：正常對照組；慢病毒感染組：攜帶β3-AR的慢病毒感染心肌成纖維細(xì)胞1h后再加入AngⅡ培養(yǎng)72h；空病毒對照組：空的慢病毒感染心肌成纖維細(xì)胞1h后再加入AngⅡ培養(yǎng)72h；AngⅡ組：加入AngⅡ培養(yǎng)72h。實驗分組2：正常對照組；BRL組：先加入

4、BRL，1h后加入AngⅡ培養(yǎng)72h；SR組：先加入SR，1h后加入AngⅡ培養(yǎng)72h；AngⅡ組：加入AngⅡ培養(yǎng)72h。
　　結(jié)果：
　　1.慢病毒成功感染心肌成纖維細(xì)胞，最適MOI為100，感染72h時效果最佳，感染率達(dá)到72.9﹪；
　　2.Western blot檢測結(jié)果示：慢病毒感染及激動劑干預(yù)都能使心肌成纖維細(xì)胞β3-AR高表達(dá)，較正常對照組及AngⅡ組均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），慢病毒感

5、染組β3-AR表達(dá)高于激動劑干預(yù)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），拮抗劑干預(yù)組β3-AR表達(dá)較AngⅡ組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　3.Western blot檢測結(jié)果示：慢病毒感染組心肌成纖維細(xì)胞中TGF-β/Smad信號通路及纖維化相關(guān)因子COL-I、COL-Ⅲ蛋白表達(dá)水平較空病毒感染組、AngⅡ組及正常對照組相比均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），空病毒感染組與AngⅡ組表達(dá)水平無明顯差別（

6、P>0.05），但均高于正常對照組（P<0.05），β3-AR激動劑干預(yù)組表達(dá)高于β3-AR拮抗劑干預(yù)組、AngⅡ組和正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），β3-AR拮抗劑干預(yù)組表達(dá)較AngⅡ組降低，但仍高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　4.qRT-PCR檢測慢病毒感染組心肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1、COL-I、COL-Ⅲ mRNA水平與空病毒感染組、AngⅡ組及正常對照組相比均升高，差異均有統(tǒng)計

7、學(xué)意義（P<0.05），空病毒感染組與AngⅡ組無明顯差別（P>0.05），但均高于正常對照組（P<0.05），β3-AR激動劑干預(yù)組TGF-β1、COL-I、COL-Ⅲ mRNA水平高于β3-AR拮抗劑干預(yù)組、AngⅡ組和正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），β3-AR拮抗劑干預(yù)組水平較AngⅡ組降低，但仍高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　5.WST-1測心肌成纖維細(xì)胞增殖情況：慢病毒感染組心肌

8、成纖維細(xì)胞增殖水平與空病毒感染組、AngⅡ組及正常對照組相比均增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），空病毒感染組與AngⅡ組無明顯差別（P>0.05），但均高于正常對照組（P<0.05），β3-AR激動劑干預(yù)組較拮抗劑干預(yù)組、AngⅡ組及正常對照組相比增殖水平均增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），β3-AR拮抗劑干預(yù)組增殖水平較AngⅡ組降低，但仍高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　

9、　1.慢病毒感染和β3-AR激動劑干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞均能使β3-AR過表達(dá)；
　　2.β3-AR過表達(dá)可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和纖維化；
　　3.β3-AR過表達(dá)可能通過TGF-β/Smad信號通路介導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞纖維化，促進(jìn)心肌重構(gòu)，參與心力衰竭的進(jìn)展。
　　目的：
　　使用AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞纖維化，應(yīng)用攜帶β3-AR基因片段的慢病毒感染、β3-AR激動劑及拮抗劑的方法對心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察β

10、3-AR對心肌成纖維細(xì)胞纖維化的影響，探討β3-AR與TGF-β/Smad信號通路對心肌成纖維細(xì)胞纖維化的作用，證明β3-AR激活后可能通過TGF-β/Smad信號通路介導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞纖維化，促進(jìn)心肌重構(gòu)。
　　方法：
　　使用差速貼壁法分離培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞，分別用攜帶β3-AR基因片段的慢病毒感染、β3-AR激動劑及拮抗劑干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞，流式儀檢測心肌成纖維細(xì)胞的最佳慢病毒感染率，篩選出慢病毒對心肌成纖維細(xì)胞的最適

11、感染復(fù)數(shù)。用膜蛋白試劑盒提取心肌成纖維細(xì)胞β3-AR膜蛋白，普通試劑盒提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，Western blot法檢測各樣品中β3-AR蛋白的特異性，分別觀察慢病毒感染和β3-AR激動劑拮抗劑誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中β3-AR及纖維化相關(guān)因子的表達(dá)水平及其相關(guān)性。Western blot和qRT-PCR檢測各組TGF-β/Smad信號通路及纖維化相關(guān)因子COL-I、COL-Ⅲ蛋白表達(dá)和mRNA的水平。WST-1法檢測各組心

12、肌成纖維細(xì)胞增殖情況。實驗分組1：正常對照組；慢病毒感染組：攜帶β3-AR的慢病毒感染心肌成纖維細(xì)胞1h后再加入AngⅡ培養(yǎng)72h；空病毒對照組：空的慢病毒感染心肌成纖維細(xì)胞1h后再加入AngⅡ培養(yǎng)72h；AngⅡ組：加入AngⅡ培養(yǎng)72h。實驗分組2：正常對照組；BRL組：先加入BRL，1h后加入AngⅡ培養(yǎng)72h；SR組：先加入SR，1h后加入AngⅡ培養(yǎng)72h；AngⅡ組：加入AngⅡ培養(yǎng)72h。
　　結(jié)果：
　　1.

13、慢病毒成功感染心肌成纖維細(xì)胞，最適MOI為100，感染72h時效果最佳，感染率達(dá)到72.9﹪；
　　2.Western blot檢測結(jié)果示：慢病毒感染及激動劑干預(yù)都能使心肌成纖維細(xì)胞β3-AR高表達(dá)，較正常對照組及AngⅡ組均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），慢病毒感染組β3-AR表達(dá)高于激動劑干預(yù)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），拮抗劑干預(yù)組β3-AR表達(dá)較AngⅡ組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；

14、>　　3.Western blot檢測結(jié)果示：慢病毒感染組心肌成纖維細(xì)胞中TGF-β/Smad信號通路及纖維化相關(guān)因子COL-I、COL-Ⅲ蛋白表達(dá)水平較空病毒感染組、AngⅡ組及正常對照組相比均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），空病毒感染組與AngⅡ組表達(dá)水平無明顯差別（P>0.05），但均高于正常對照組（P<0.05），β3-AR激動劑干預(yù)組表達(dá)高于β3-AR拮抗劑干預(yù)組、AngⅡ組和正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.

15、05），β3-AR拮抗劑干預(yù)組表達(dá)較AngⅡ組降低，但仍高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　4.qRT-PCR檢測慢病毒感染組心肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1、COL-I、COL-Ⅲ mRNA水平與空病毒感染組、AngⅡ組及正常對照組相比均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），空病毒感染組與AngⅡ組無明顯差別（P>0.05），但均高于正常對照組（P<0.05），β3-AR激動劑干預(yù)組TGF-β1、COL-I

16、、COL-Ⅲ mRNA水平高于β3-AR拮抗劑干預(yù)組、AngⅡ組和正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），β3-AR拮抗劑干預(yù)組水平較AngⅡ組降低，但仍高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　5.WST-1測心肌成纖維細(xì)胞增殖情況：慢病毒感染組心肌成纖維細(xì)胞增殖水平與空病毒感染組、AngⅡ組及正常對照組相比均增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），空病毒感染組與AngⅡ組無明顯差別（P>0.05），但

17、均高于正常對照組（P<0.05），β3-AR激動劑干預(yù)組較拮抗劑干預(yù)組、AngⅡ組及正常對照組相比增殖水平均增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），β3-AR拮抗劑干預(yù)組增殖水平較AngⅡ組降低，但仍高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.慢病毒感染和β3-AR激動劑干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞均能使β3-AR過表達(dá)；
　　2.β3-AR過表達(dá)可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和纖維化；
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