百脈根結(jié)瘤信號途徑中相關(guān)調(diào)控蛋白的功能和作用機制的研究.pdf

1、氮素是自然界中植物生長的最主要的限制因子之一。豆科植物與根瘤菌之間的根瘤共生(RNS,root nodule symbiosis)固氮系統(tǒng)是自然界中氮素最直接和經(jīng)濟的來源,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的意義。然而,共生固氮具有宿主專一性,僅限于豆科植物和極個別非豆科植物,目前想通過遺傳工程的方法實現(xiàn)重要谷類作物的共生固氮仍面臨巨大的挑戰(zhàn),有待于共生固氮分子機理的進一步揭示。
　　 根瘤的形成過程可分為根瘤菌侵染和根瘤器官發(fā)生兩個復(fù)雜

2、的過程。近十年來,以模式豆科植物苜蓿(Medicago truncatula)和百脈根(Lotus japonicus)為材料,在宿主植物中鑒定出一系列與共生相關(guān)的基因,初步建立了共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式圖。其中依賴鈣和鈣調(diào)素的蛋白激酶(CCaMK)和兩個GRAS類轉(zhuǎn)錄因子(NSP1和NSP2)同時控制根瘤菌侵染和根瘤器官發(fā)生兩個過程,并預(yù)測CCaMK、NSP1和NSP2形成復(fù)合體行使功能,但缺乏明確的生物化學(xué)和分子生物學(xué)證據(jù)。本論文以百脈根為

3、材料,圍繞CCaMK、NSP1和NSP2三個基因開展了以下三個方面的工作:
　　 1.分別以CCaMK,CCaMK自磷酸化位點突變形式CCaMK(T265I)和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域CCaMK(1-300aa)為誘餌,篩選百脈根AD-cDNA酵母雙雜交文庫。其中以蛋白激酶結(jié)構(gòu)域為誘餌鑒定到一個新蛋白,命名為CIP73(CCaMK interactingprotein of approximately73 kDa)。CIP73開放閱讀框包

4、含2,076個核苷酸,編碼的蛋白質(zhì)由691個氨基酸殘基組成,分子量約為73 kD。蛋白質(zhì)序列分析顯示CIP73的N端含有一個和泛素(ubiquitin)同源的類似Scythe_N結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。只有當CCaMK的C端鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和EF hand結(jié)構(gòu)域去除后CCaMK才能與CIP73在酵母細胞中相互作用。進一步的缺失突變分析顯示CCaMK的N端80個氨基酸(residues80-160)是與CIP73相互作用所必需的。雖然全長的CCaM

5、K與CIP73在酵母細胞中沒有檢測到相互作用,但體外蛋白Pull-down和體內(nèi)雙分子熒光互補(BiFC)實驗證明全長CCaMK與CIP73之間存在相互作用。通過半定量RT-PCR,檢查了CIP73和CCaMK在百脈根不同器官中的表達情況。相對于莖和葉,CIP73和CCaMK在根中都大量表達,不同的是CIP73在根瘤中僅檢測到微弱的表達,而CCaMK在根瘤中大量表達。接種了根瘤菌后CIP73的表達和CCaMK相似,有一個有明顯的表達量下

6、降的過程。CIP73的C端CIP73(486-691)與GFP的融合蛋白在洋蔥表皮細胞和百脈根毛根細胞的細胞核中能檢測到很強的熒光。更重要的是,在鈣離子和鈣調(diào)素存在的條件下,CCaMK在體外能夠磷酸化CIP73的N端(1—413aa)區(qū)域。RNA干擾(RNAI)降低CIP73的表達能抑制結(jié)瘤,但對菌根共生沒有明顯的影響,表明CIP73在結(jié)瘤過程中行使重要功能。
　　 2.百脈根CCaMK的自磷酸化位點突變后,在沒有根瘤菌的情況下

7、能形成自發(fā)根瘤。另一方面,水稻的CCaMK能夠互補百脈根CCaMK失去功能的突變表型,并且水稻CCaMK突變影響菌根共生。為了研究CCaMK在水稻中的共生效應(yīng),分別構(gòu)建了水稻和百脈根CCaMK的自磷酸化位點突變Os T263A和Lj T265I的超表達(雙CaMV35S)和自身啟動子表達載體,并轉(zhuǎn)入水稻中,收獲了T1代轉(zhuǎn)基因種子。PCR擴增目標基因和GUS染色鑒定每個片段均有20多個陽性轉(zhuǎn)基因系,但其共生效應(yīng)還有待于進一步實驗驗證。

8、r>　　 3.以NSP2的GRAS結(jié)構(gòu)域為誘餌,在百脈根AD-cDNA酵母雙雜交文庫中鑒定到一個與。NSP2相互作用的新蛋白,命名為IPN2(Interacting Protein of NSP2)。IPN2開放閱讀框包含1,074個核苷酸,編碼的蛋白質(zhì)由358個氨基酸殘基組成,分子量約為40 kD。蛋白質(zhì)序列分析顯示IPN2的N端含有一個單個重復(fù)的MYB類結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域和一個預(yù)測的coiled-coil結(jié)構(gòu)域。在酵母中,NSP2的

9、GRAS結(jié)構(gòu)域是和IPN2相互作用所必需的,而IPN2的coiled-coil結(jié)構(gòu)域是和NSP2相互作用所必需的。另外通過體外蛋白Pull-down和體內(nèi)雙分子熒光互補(BiFC)實驗進一步證實了NSP2與IPN2之間的相互作用。而且,NSP2與IPN2共定位于百脈根毛根細胞的細胞核中。IPN2在酵母細胞中有很強的轉(zhuǎn)錄激活作用,并且能結(jié)合NIN的啟動子。IPN2的mRNA在百脈根不同器官中廣泛表達,并且其啟動子在轉(zhuǎn)基因毛根的韌皮部特異表