信號調(diào)節(jié)蛋白α調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞功能的作用與機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分、信號調(diào)節(jié)蛋白α調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞功能的作用與機制研究
　　 研究背景和目的：
　　 肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是肝癌中最常見的類型，占所有原位肝癌病例的90％以上。研究表明，慢性炎性反應與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我國肝癌患者大多伴有長期慢性病毒感染及大量免疫細胞侵潤，因此腫瘤不同部位免疫微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。巨噬細胞具有高度

2、的可塑性，不同的環(huán)境因素刺激呈現(xiàn)不同的表型。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)是腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞，是腫瘤微環(huán)境中侵潤的炎性細胞的最主要成分。研究表明腫瘤細胞通過分泌細胞因子、趨化因子等(如CSF1、MCP-1)從外周血中募集單核細胞到達腫瘤局部，誘導分化形成TAMs。TAMs的活化類似于巨噬細胞的選擇性激活(alternative activation，M2-1ike)。臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤組織中TAMs的密度與腫瘤預后密切相關(guān)

3、，如肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等。進一步研究認為:TAMs在腫瘤細胞的增殖、存活、浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用。但是也有研究指出，腫瘤癌旁組織中巨噬細胞呈現(xiàn)類似經(jīng)典激活的表型(classical activation，Ml-like)，并通過促進血管新生等機制促進腫瘤發(fā)展。目前，巨噬細胞作為腫瘤間質(zhì)的重要組成部分，其對腫瘤局部微環(huán)境調(diào)節(jié)的分子機制逐漸成為研究的熱點。
　　 信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)是一類廣泛表達的糖蛋白分子，屬于免疫球

4、蛋白超家族結(jié)構(gòu)域。SIRPα在免疫細胞中特異表達在巨噬細胞和樹突狀細胞等髓系細胞表面。SIRPα的胞內(nèi)段含有富含酪氨酸的免疫抑制性基序(ITIMs)，在多種刺激下發(fā)生磷酸化并與下游分子SHP1/SHP2結(jié)合，調(diào)節(jié)信號的強度和持續(xù)時間。研究表明SIRPα參與維持小鼠T細胞與NK細胞的穩(wěn)態(tài)，我們實驗室先前發(fā)現(xiàn)SIRPα負性調(diào)節(jié)Toll受體介導的巨噬細胞固有免疫，提示SIRPα參與了機體免疫系統(tǒng)的發(fā)育與免疫細胞的活化。
　　 目前關(guān)于

5、SIRPα在巨噬細胞介導的腫瘤免疫中的作用機制尚未見報道。我們發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細胞SIRPα的表達水平在肝癌患者與正常人外周血中無明顯差異，但在肝癌癌旁組織中表達明顯降低，而在肝癌癌巢組織中呈現(xiàn)一定水平的恢復。體外研究表明肝癌細胞誘導巨噬細胞SIRPα的表達水平明顯下調(diào)。以上結(jié)果提示SIRPα對腫瘤微環(huán)境誘導的巨噬細胞激活可能存在調(diào)節(jié)作用。為了解SIRPα在巨噬細胞腫瘤免疫中的作用和機制，本課題通過siRNA轉(zhuǎn)染或慢病毒感染干擾小鼠骨髓來

6、源巨噬細胞(BMDMs)中SIRPα的表達，利用共培養(yǎng)研究體系，探討了SIRPα對肝癌細胞誘導的巨噬細胞活化的影響，全面探討了SIRPα對巨噬細胞表型、遷移和存活的調(diào)節(jié)，并探討SIRPα對腫瘤誘導的巨噬細胞PI3K-Akt和NF-κB等信號通路活化的影響。為進一步探討SIRPα對腫瘤進程的調(diào)節(jié)，本課題通過小鼠體內(nèi)回輸差異表達SIRPα的巨噬細胞，利用不同的小鼠荷瘤模型，研究巨噬細胞SIRPα對腫瘤體內(nèi)生長的影響，并進一步探討SIRPα發(fā)

7、揮上述作用的可能機制，確定了SIRPα在腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞功能調(diào)節(jié)中的重要地位，為腫瘤的治療提供新策略和新思路。
　　 實驗方法：
　　 1.收集臨床肝癌患者新鮮腫瘤與癌旁組織樣本以及肝癌患者與正常健康人的外周血樣本，通過消化與密度梯度離心方法分離獲得單核/巨噬細胞，利用流式細胞檢測單核/巨噬細胞中SIRPα的表達。結(jié)合患者臨床資料，統(tǒng)計分析腫瘤組織巨噬細胞SIRPα的表達、癌旁組織巨噬細胞SIRPα的表達、腫瘤/癌旁

8、組織巨噬細胞SIRPα的表達與腫瘤臨床資料的相關(guān)性。
　　 2.C57BL/6來源的小鼠肝癌細胞系Hepal-6皮下接種同系小鼠，成瘤后分離小鼠外周血及腫瘤組織中單核/巨噬細胞，檢測SIRPα的表達;Balb/c來源的小鼠肝癌細胞H22腹腔接種同系小鼠，待成瘤后檢測外周血及腹水中單核/巨噬細胞SIRPα的表達。
　　 3.誘導培養(yǎng)小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDMs)，利用transwell共培養(yǎng)體系（0.4μm），檢測肝癌

9、細胞對巨噬細胞SIRPα表達的調(diào)節(jié)及巨噬細胞活化標志(MHCⅡ、細胞因子表達)等;通過H2O2、缺氧等各種刺激模擬腫瘤微環(huán)境，檢測巨噬細胞SIRPα的表達。
　　 4.合成并鑒定具有特異干擾效果的siRNA或包裝慢病毒，干擾巨噬細胞SIRPα、SHP2的表達。
　　 5.利用transwell共培養(yǎng)體系（0.4μm），采用ELISA、Real-time PCR等方法檢測差異表達SIRPα的巨噬細胞在腫瘤細胞刺激下細胞因子

10、（如TNFα、IL6、IL10、IL12等）表達和分泌的變化。
　　 6.運用特異磷酸化抗體檢測SIRPα對巨噬細胞Stat3、NF-κB、PI3K-Akt等信號通路活化的作用;利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測NF-κB和iNOS的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 7.利用transwell遷移體系(5.0μm)，檢測差異表達SIRPα的巨噬細胞向腫瘤細胞遷移能力的差別;利用CMFDA標記巨噬細胞體內(nèi)檢測SIRPα對巨噬細胞遷移至腫瘤組織的

11、能力的影響。
　　 8.檢測SIRPα表達對MCP-1、CSF1誘導的巨噬細胞遷移能力的調(diào)節(jié);利用特異性磷酸化抗體檢測PLCγ、Rac等遷移相關(guān)信號分子的活化。
　　 9.利用TNFα+CHX、TRAIL等刺激模擬腫瘤微環(huán)境中存在的促凋亡因子誘導巨噬細胞發(fā)生凋亡，檢測SIRPα對巨噬細胞在不利刺激下凋亡水平的調(diào)節(jié)。
　　 10.采用清除體內(nèi)巨噬細胞再靜脈輸入巨噬細胞的方法獲得體內(nèi)具有不同SIRPα表達水平的巨噬細

12、胞的C57BL/6小鼠，將C57L來源的小鼠肝癌細胞系Hepa1-6通過皮下荷瘤或原位荷瘤等方法接種小鼠，觀察腫瘤的體內(nèi)生長差異;采用同樣的方法獲得具有不同SIRPα表達水平的巨噬細胞的Balb/c小鼠，將Balb/c來源的H22細胞通過腹腔注射的方法接種小鼠，觀察腫瘤的生長差異，記錄不同組小鼠的荷瘤生存時間。
　　 11.檢測差異表達SIRPα的巨噬細胞對腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié):收集上述小鼠的Hepa1-6腫瘤樣本，通過Real-t

13、ime PCR等方法檢測腫瘤組織中炎性因子(TNFα、IL6、VEGF等)的表達水平;收集H22荷瘤小鼠的腹水，ELISA檢測腹水中炎性因子的分泌水平。
　　 12.采用免疫組化的方法檢測具有不同SIRPα表達水平的巨噬細胞的小鼠腫瘤樣本中血管新生的差異;通過Western-blot和熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測SIRPα對巨噬細胞介導的血管新生相關(guān)信號通路HIF1α-NFAT-COX2-VEGF的調(diào)節(jié)。
　　 13.采用免

14、疫共沉淀的方法確定SIRPα與SHP2的相互作用及與SHP2相互作用的蛋白。
　　 14.采用瞬時干擾SHP2后檢測其對腫瘤誘導的巨噬細胞釋放細胞因子和信號通路磷酸化的調(diào)節(jié)，確定SHP2在巨噬細胞活化中的作用。
　　 15.采用免疫共沉淀的方法檢測SIRPα的不同表達是否影響SHP2與下游相互作用蛋白的結(jié)合。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.SIRPα在腫瘤患者中的表達:單核/巨噬細胞SIRPα的表達水平在肝

15、癌患者與正常人外周血中無明顯差異，但在肝癌癌旁組織中表達明顯降低，而在肝癌癌巢組織中呈現(xiàn)一定水平的恢復。體外研究表明肝癌細胞誘導巨噬細胞SIRPα的表達水平明顯下調(diào)。
　　 2.SIRPα在小鼠肝癌荷瘤樣本中的表達:與正常小鼠相比，荷瘤小鼠外周血單核/巨噬細胞SIRPα的表達無明顯差異;Hepa1-6荷瘤小鼠腫瘤組織及H22腫瘤腹水中巨噬細胞SIRPα的表達明顯低于相應的小鼠外周血單核細胞。
　　 3.腫瘤細胞誘導巨噬細

16、胞SIRPα表達下調(diào):與正常培養(yǎng)及小鼠原代肝細胞共培樣的巨噬細胞相比，腫瘤細胞誘導巨噬細胞SIRPα表達早期快速下調(diào)，并伴隨著巨噬細胞的活化（MHCⅡ表達升高、細胞因子釋放）;與腫瘤細胞共培養(yǎng)較長時間(5天)后，巨噬細胞SIRPα表達恢復，并伴隨巨噬細胞免疫抑制表型(MHCⅡ表達下降、細胞因子釋放減少)。
　　 4.腫瘤微環(huán)境中的因子參與誘導巨噬細胞SIRPα的下調(diào):腫瘤微環(huán)境中的炎性因子如TNFα、缺氧、高ROS水平(H2O2

17、)等刺激能誘導巨噬細胞SIRPα表達的下調(diào);利用特異性中和TNFα的抗體能部分抑制腫瘤細胞誘導的巨噬細胞SIRPα表達的下調(diào)。
　　 5.腫瘤微環(huán)境引起巨噬細胞SIRPα表達下調(diào)的機制:巨噬細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)不同的時間點，Real-time PCR檢測巨噬細胞SIRPα的表達水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境可以誘導巨噬細胞SIRPα轉(zhuǎn)錄水平的下降。利用不同的蛋白酶體和溶酶體抑制劑處理巨噬細胞后發(fā)現(xiàn)腫瘤誘導的巨噬細胞SIRPα蛋白水平的下調(diào)

18、部分通過溶酶體介導的蛋白降解途徑參與。
　　 6.SIRPα調(diào)節(jié)巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的表型:細胞因子、信號分子檢測的結(jié)果表明，SIRPα抑制腫瘤誘導的巨噬細胞炎性因子TNFα、 IL6的釋放和免疫抑制因子IL10的表達;進一步研究表明SIRPα抑制巨噬細胞Arg1的表達，促進NOS2的表達;此外，SIRPα抑制腫瘤誘導的巨噬細胞NF-κB和Stat3的活化，促進Stat1的磷酸化。
　　 7.SIRPα調(diào)節(jié)巨噬細胞向腫

19、瘤細胞遷移:體內(nèi)外實驗表明SIRPα顯著抑制巨噬細胞向腫瘤細胞的遷移;此外SIRPα顯著抑制MCP-1、CSF1誘導的巨噬細胞遷移及相應信號分子PLCγ和Rac的活化。
　　 8.SIRPα調(diào)節(jié)巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的存活:低表達SIRPα的巨噬細胞在促凋亡信號刺激下的細胞凋亡水平明顯受到抑制;SIRPα抑制細胞存活相關(guān)信號PI3K-Akt的活化。
　　 9.巨噬細胞SIRPα的表達對腫瘤生長的影響:采用清除體內(nèi)巨噬細胞

20、再靜脈輸入巨噬細胞的方法獲得體內(nèi)具有不同SIRPα表達水平的巨噬細胞的C57BL/6小鼠，將C57L來源的小鼠肝癌細胞系Hepa1-6通過皮下荷瘤或原位荷瘤等方法接種小鼠，發(fā)現(xiàn)干擾SIRPα表達的巨噬細胞顯著促進腫瘤的體內(nèi)生長;采用同樣的方法獲得具有不同SIRPα表達水平的巨噬細胞的Balb/c小鼠，將Balb/c來源的H22細胞通過腹腔注射的方法接種小鼠，發(fā)現(xiàn)干擾SIRPα表達的巨噬細胞明顯縮短了小鼠的生存時間。
　　 10.

21、巨噬細胞SIRPα的表達對腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)的調(diào)節(jié):通過Real-time PCR和ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)低表達SIRPα的巨噬細胞促進腫瘤微環(huán)境中炎性因子的表達。此外，低表達SIRPα的巨噬細胞促進腫瘤細胞的增殖和Stat3及NF-κB信號通路的活化。
　　 11.巨噬細胞SIRPα的表達對腫瘤血管新生的調(diào)節(jié):免疫組化染色發(fā)現(xiàn)低表達SIRPα的巨噬細胞促進腫瘤血管新生;進一步研究顯示腫瘤微環(huán)境中低表達SIRPα的巨噬細胞其血管新

22、生相關(guān)通路HIF1α-NFAT-COX2-VEGF明顯增強。
　　 12.SIRPα調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞功能的機制:腫瘤細胞刺激巨噬細胞后可以發(fā)現(xiàn)SIRPα發(fā)生磷酸化，SIRPα磷酸化后可與SHP2和PI3K激酶調(diào)節(jié)亞基PI3Kp85結(jié)合;瞬時干擾SHP2表達后可見SHP2正性調(diào)節(jié)腫瘤誘導的巨噬細胞NF-κB和PI3K-Akt信號通路活化及相應炎性因子的表達;進一步研究表明SIRPα對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用部分通過SHP2發(fā)揮作

23、用的，SIRPα低表達顯著提高SHP2與IKKβ的結(jié)合，促進IKK復合物的活化和NF-κB信號通路的激活;進一步研究發(fā)現(xiàn)SIRPα低表達顯著增強SHP2與PI3Kp85的結(jié)合，增強PI3K催化亞基PI3Kp110的活性。所以SIRPα可能通過競爭性抑制SHP2與IKKs和PI3Kp85亞基的結(jié)合，抑制巨噬細胞NF-κB和PI3K-Akt信號通路活化。
　　 結(jié)論：
　　 本研究從分子-細胞-動物-臨床水平全面深入研究了信

24、號調(diào)節(jié)蛋白α對腫瘤相關(guān)巨噬細胞功能的調(diào)節(jié)作用和分子機制。本課題研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞通過分泌可溶性因子等方式誘導巨噬細胞SIRPα表達下調(diào)，促進巨噬細胞遷移至腫瘤局部并增強其在腫瘤微環(huán)境中存活的能力;低表達SIRPα的巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中分泌炎性因子及血管新生因子的能力顯著增強，參與促腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)，進而促進腫瘤的發(fā)展，形成正反饋調(diào)節(jié)通路。因此，腫瘤細胞誘導的巨噬細胞SIRPα表達下調(diào)可能是腫瘤促進自身發(fā)生發(fā)展的重要途徑。本課題還深入討論

25、了SIRPα調(diào)節(jié)巨噬細胞相關(guān)信號通路的作用機制，證明其可能通過競爭抑制SHP2與IKKs復合物和PI3K復合物相結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。
　　 第二部分、信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)負性調(diào)節(jié)IgE誘導的肥大細胞活化
　　 研究背景及目的：
　　 目前過敏性疾病的發(fā)病率顯著上升，Ⅰ型超敏反應就是其中一種重要的類型。Ⅰ型超敏反應發(fā)病突然，迅速引起機體損傷，嚴重時可能威脅生命。能夠致敏的抗原性物質(zhì)在自然界廣泛存在，可以經(jīng)呼吸

26、道消化道或皮膚接觸等途徑進入體內(nèi)，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白E(IgE)。IgE分子可以與效應細胞表面受體FcεRI穩(wěn)定結(jié)合，當特異抗原再次進入體內(nèi)，可以同IgE分子結(jié)合并且使相鄰的FcεRI交聯(lián)，引起細胞活化。FcεRI是由α鏈、β鏈和兩條γ鏈組成的四聚體。FcεRIα鏈含有配體結(jié)合鏈， IgE的Fc段結(jié)合后，募集激活β鏈和γ鏈的ITAM區(qū)，使ITAM發(fā)生磷酸化并介導下游信號傳遞。肥大細胞是Ⅰ型超敏反應的重要效應細胞，主

27、要通過脫顆粒和分泌炎性因子等發(fā)揮其生物學作用。
　　 免疫細胞的激活及免疫反應的強度和范圍受到多種機制調(diào)節(jié)，目前認為，免疫反應正性和負性信號的平衡是維持機體免疫穩(wěn)態(tài)的主要方式。免疫反應的負性信號就包括抑制性受體介導的信號調(diào)控。信號調(diào)節(jié)蛋白家族(SIRP)就是一類細胞表面的抑制性受體。信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory proteinα，SIRPα)屬于免疫球蛋白受體超家族，SIRPα主要表達在神經(jīng)元細胞及髓系來源

28、細胞，如肥大細胞。SIRPα胞外區(qū)具有三個IgSF樣結(jié)構(gòu)域和多個糖基化位點，胞內(nèi)區(qū)帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIMs)，能夠發(fā)生磷酸化并募集信號分子，目前研究表明，SIRPα的下游分子主要包括SHP-1和SHP-2。
　　 SIRPα對肥大細胞功能的調(diào)節(jié)尚未見系統(tǒng)性報道。我們研究發(fā)現(xiàn)IgE-DNP介導的肥大細胞激活后SIRPα表達水平下降，提示SIRPα對肥大細胞活化可能存在抑制作用。為進一步了解SIRPα在肥大細胞活化過程

29、中的作用，本課題通過通過差異表達SIRPα的肥大細胞研究了SIRPα在抗原誘導肥大細胞活化中的作用。
　　 實驗方法：
　　 1.分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源肥大細胞(BMMCs)，合成鑒定具有特異干擾SIRPα表達的siRNA，瞬時干擾BMMCs SIRPα的表達;利用大鼠肥大細胞系RBL-2H3，建立穩(wěn)定高表達Myc-SIRPα和轉(zhuǎn)染空載體對照的細胞系;
　　 2.檢測肥大細胞活化后β-氨基己糖胺酶的釋放，研究體外S

30、IRPα對肥大細胞脫顆粒的調(diào)節(jié);
　　 3.利用肥大細胞缺失小鼠（c-kitwsh/wsh），重構(gòu)肥大細胞系統(tǒng)，進行被動皮膚過敏反應，體內(nèi)觀察SIRPα對肥大細胞脫顆粒的調(diào)節(jié);
　　 4.肥大細胞脫顆粒與細胞骨架重排密切相關(guān)，采用熒光探針檢測SIRPα對細胞骨架F-actin聚合的調(diào)節(jié);檢測SIRPα對細胞微管形成的影響;
　　 5.細胞骨架重排與胞內(nèi)鈣離子流動有關(guān)，使用Ca+指示劑檢測SIRPα對抗原引起肥大活

31、化過程中Ca2+流動的調(diào)節(jié);
　　 6.檢測SIRPα對肥大細胞活化后細胞因子表達分泌的調(diào)節(jié);
　　 7.檢測SIRPα對肥大細胞活化MAPK、NFAT等信號通路的調(diào)節(jié);
　　 8.檢測SIRPα調(diào)節(jié)肥大細胞活化的分子機制。
　　 結(jié)果：
　　 1.SIRPα參與抗原誘導的肥大細胞活化過程:肥大細胞活化過程中SIRPα表達降低，并呈現(xiàn)抗原劑量與時間依賴性。SIRPα發(fā)生磷酸化并募集SHP-1和SH

32、P-2。
　　 2.SIRPα調(diào)節(jié)肥大細胞活化后脫顆粒:SIRPα顯著抑制體外肥大細胞脫顆粒和體內(nèi)PCA反應引起的血管滲出;
　　 3.SIRPα抑制肥大細胞活化過程中的細胞骨架改變:SIRPα抑制肥大細胞活化過程中tubulin聚合及F-actin解聚;
　　 4.SIRPα抑制肥大細胞Ca2+釋放，提示SIRPα能夠通過調(diào)節(jié)Ca2+釋放影響肥大細胞骨架改變及脫顆粒過程;此外SIRPα明顯抑制Rac-1 GTP

33、ase的活性，進而抑制了微管的形成。
　　 5.SIRPα抑制肥大細胞細胞因子合成分泌:抗原誘導的肥大細胞活化過程中，SIRPα通過抑制MAPK信號通路磷酸化以及轉(zhuǎn)錄因子NFκB和NFAT活性，抑制肥大細胞由抗原誘導的炎性因子合成與分泌。
　　 6.SIRPα在抗原誘導的肥大細胞活化過程中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用的機制:肥大細胞活化引起SIRPα發(fā)生磷酸化。隨后SIRPα通過競爭結(jié)合SHP-2，影響SHP-2與PI3Kp85及I