菌群及巨噬細(xì)胞脂質(zhì)分解在血脂調(diào)節(jié)中的作用與機(jī)制.pdf

1、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心?。┦侵欣夏曜畛Ｒ姷男难芗膊?，其主要病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)。隨著生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，AS發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。
　　眾多流行病學(xué)研究顯示，血脂代謝紊亂和炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用，尤其是血液中低密度脂蛋白-膽固醇(Low Density Lipoprotein-Cholesterol，LDL-C)的升高已證實(shí)為動(dòng)脈

2、粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。調(diào)控血脂水平的機(jī)制極其復(fù)雜，除了常見的遺傳及環(huán)境因素外，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，菌群在代謝性心血管疾病中起到了重要作用，干預(yù)菌群能夠預(yù)防、甚至臨床治愈代謝性心血管病，但菌群是否通過改變血脂代謝來影響心血管疾病的發(fā)生發(fā)展目前尚不明確，仍需要進(jìn)一步研究。體內(nèi)膽固醇平衡是由三條主要代謝通路控制，包括自身合成，膽汁糞便排出以及腸道吸收。腸道膽固醇吸收是尼曼匹克C1樣蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NP

3、C1L1)蛋白介導(dǎo)的主動(dòng)吸收過程，前期研究證實(shí)，NPC1L1基因敲除小鼠不僅有腸道膽固醇吸收缺陷，而且糞便量也明顯減少。菌群是糞便的重要組成部分，提示腸道菌群可能參與了NPC1L1基因調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇代謝的過程，但具體機(jī)制尚不清楚。
　　早期動(dòng)脈粥樣硬化的重要特征是巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞在血管內(nèi)皮下的沉積。泡沫細(xì)胞的主要成分是膽固醇酯和甘油三酯，CGI-58(Comparative gene identification-58)是細(xì)

4、胞內(nèi)脂質(zhì)分解的激活因子，主要通過激活脂肪甘油三酯水解酶(adiposetriglyceride lipase，ATGL)的活性促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分解。前期研究發(fā)現(xiàn)，CGI-58缺失的巨噬細(xì)胞類似泡沫細(xì)胞，有大量的甘油三酯(Triglyceride，TG)和膽固醇酯沉積，并呈現(xiàn)促炎表型，但CGI-58導(dǎo)致的脂質(zhì)紊亂和炎性改變是否對動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響目前尚無定論?？紤]到泡沫細(xì)胞與炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的病理基礎(chǔ)，因此，研究巨噬細(xì)胞

5、CGI-58與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系至關(guān)重要。
　　目的：
　　1.探討菌群對體內(nèi)膽固醇代謝平衡調(diào)節(jié)的影響及其在NPC1L1調(diào)節(jié)膽固醇吸收中的作用及相關(guān)機(jī)制，篩選與腸道膽固醇吸收相關(guān)的腸道菌群為今后進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。
　　2.建立巨噬細(xì)胞特異性CGI-58敲除的動(dòng)脈粥樣硬化模型，在動(dòng)脈粥樣硬化模型基礎(chǔ)上探討巨噬細(xì)胞CGI-58對脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.腸道菌群與小

6、鼠體內(nèi)膽固醇代謝的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制
　　1.1無菌(Germ-free，GF)小鼠是現(xiàn)階段研究腸道菌群與疾病相關(guān)性的一個(gè)必要模型，本研究第一部分動(dòng)物模型選用無菌小鼠和普通無特殊病原體(Specificpathogen-free，SPF)小鼠，并按照在Western Diet中混合或者未混合膽固醇吸收抑制劑依折麥布(Ezetimibe)作為分組標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)分為SPF+WD飲食組，SPF+WD飲食+Ezetimibe組，GF+WD飲

7、食組，GF+WD飲食+Ezetimibe組。
　　1.2[14C]-cholesterol和[3H]-Sitosterol的同比例混合溶液被灌胃進(jìn)入小鼠體內(nèi)，運(yùn)用雙同位素標(biāo)記法檢測各組小鼠糞便中上述同位素的dpm計(jì)數(shù)，計(jì)算出各組小鼠膽固醇腸道吸收率的改變。將5-Cholestene，β-Coprostanl，α-Cholestanone，Cholesterol等膽固醇及其相關(guān)甾醇作為標(biāo)準(zhǔn)品，運(yùn)用氣象色譜檢測等方法觀察計(jì)算各組小鼠糞

8、便中膽固醇相關(guān)甾醇排出量的情況。
　　1.3選取多種可靠的檢測試劑盒，采用萃取技術(shù)、酶學(xué)分析、ELISA等方法觀察小鼠體內(nèi)血液及組織中生化學(xué)指標(biāo)及膽固醇、甘油三酯、膽汁酸代謝的改變。
　　1.4選定相應(yīng)的引物序列及抗體，運(yùn)用Q-PCR、免疫印跡等檢測方法檢測與膽固醇、膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA及蛋白的表達(dá)，探索菌群的有無及膽固醇吸收抑制劑的參與對膽固醇及膽汁酸代謝可能的作用機(jī)制。
　　1.5聯(lián)合華大基因測序，選用宏基因

9、組檢測方法，篩選出可能的與腸道膽固醇吸收相關(guān)的腸道菌群菌屬。
　　2.探索巨噬細(xì)胞脂質(zhì)分解在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的可能作用
　　2.1從條件性巨噬細(xì)胞CGI-58敲除和野生小鼠體內(nèi)分離出腹腔及骨髓巨噬細(xì)胞，用動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因子對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察這些危險(xiǎn)因子對巨噬細(xì)胞CGI-58表達(dá)的影響及其與CGI-58相互作用對泡沫細(xì)胞形成的調(diào)控。
　　2.2建立巨噬細(xì)胞特異性CGI-58敲除的動(dòng)脈粥樣硬化模型，在西方飲食的作

10、用下，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察動(dòng)脈粥樣硬化模型下巨噬細(xì)胞CGI-58敲除小鼠與未敲除小鼠血液學(xué)指標(biāo)及其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.腸道菌群可以通過調(diào)節(jié)小鼠宿主基因表達(dá)水平從而減少體內(nèi)膽固醇丟失
　　1.1各組小鼠西方飲食和Ezetimibe共同作用后，無菌小鼠較同處理?xiàng)l件的SPF小鼠結(jié)腸重量明顯增加(P＜0.01)，但其體重、腹腔脂肪、皮下脂肪卻顯著減少(P＜0.05)。Ezetimibe的使用加速

11、了這種改變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ezetimibe喂養(yǎng)后，SPF小鼠糞便量降低，無菌鼠卻無同樣改變(P＜0.01)。
　　1.2雙同位素檢測和氣象色譜檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同樣處理?xiàng)l件下，無菌小鼠與SPF小鼠相比較，腸道膽固醇吸收率明顯降低(P＜0.05)，糞便中膽固醇及其細(xì)菌代謝產(chǎn)物排出量明顯增加(P＜0.05)。Ezetimibe在無菌小鼠中抑制膽固醇吸收和促進(jìn)糞便膽固醇排泄的作用更強(qiáng)。
　　1.3通過對膽汁中的膽固醇、磷脂及膽汁酸的檢測

12、發(fā)現(xiàn)，GF與SPF小鼠相比較，膽汁中的膽固醇含量降低(P＜0.05)。在Ezetimibe處理下，膽汁膽固醇進(jìn)一步降低，但兩組間沒有顯著變化。
　　1.4運(yùn)用ELISA和酶學(xué)檢測方法測量了不同處理小鼠血液及肝臟中的膽固醇、甘油三酯及磷脂等脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)GF小鼠血漿內(nèi)的脂質(zhì)含量均低于SPF小鼠(P＜0.05)，相較于SPF小鼠組，ezetimibe處理能夠更明顯的降低GF小鼠組內(nèi)的膽固醇及甘油三酯的含量(P＜0.05)。肝臟脂質(zhì)

13、相關(guān)指標(biāo)研究結(jié)果提示，相較于SPF小鼠，GF小鼠肝臟中的游離膽固醇，總膽固醇，膽固醇酯，甘油三酯以及磷脂含量顯著降低(P＜0.05)。Ezetimibe處理后能顯著降低SPF小鼠和GF小鼠肝臟中的脂質(zhì)含量，且GF小鼠反應(yīng)更為明顯(P＜0.05)。
　　1.5在GF小鼠空腸內(nèi)，與脂肪生成相關(guān)的基因如SREBP-1C，F(xiàn)AS以及SCD-1等表達(dá)均較SPF小鼠低(P＜0.05)。與膽汁酸激活相關(guān)的基因如FXR，OST-β以及FGF-15

14、在GF小鼠腸道內(nèi)表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)。另外，與脂蛋白代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，如:HDL受體SR-BI在GF小鼠空腸內(nèi)較SPF小鼠表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，ezetimibe的處理進(jìn)一步降低其表達(dá)水平;LDL受體在未用ezetimibe處理時(shí)SPF小鼠和GF小鼠小腸內(nèi)未見明顯的mRNA改變，但ezetimibe處理后，其mRNA水平在兩組小鼠內(nèi)表達(dá)均增加(P＜0.05)。同時(shí)，與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)及吸收相關(guān)的蛋白也有相應(yīng)改變，ABCA1

15、和NPC1L1的mRNA和蛋白水平在GF小鼠內(nèi)均降低(P＜0.05); ABCG5和ABCG8的mRNA和蛋白水平在GF小鼠內(nèi)均顯著升高(P＜0.05)。Ezetimibe處理后除了降低了ABCA1的表達(dá)外，上述基因表達(dá)均為發(fā)生明顯改變。
　　1.6與SPF小鼠相比，GF小鼠肝臟中與膽固醇合成的酶，如HMG-CoA，HMGCR，HMGCS以及FPPS的mRNA表達(dá)均上調(diào)(P＜0.05)。Ezetimibe處理進(jìn)一步升高這些基因在S

16、PF小鼠和GF小鼠中的表達(dá)(P＜0.05)。GF小鼠中感受細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的核受體LXR的靶基因，如ABCA1，SREBP-1C以及SCD-1與SPF小鼠相比較均表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)， Ezetimibe處理后GF小鼠上述基因表達(dá)下調(diào)更明顯(P＜0.05)。同時(shí)，脂蛋白受體基因如SR-BI和LDLR的mRNA及蛋白表達(dá)水平在GF小鼠肝臟中明顯增加(P＜0.05)。另外，在GF小鼠肝臟中，與膽酸代謝的相關(guān)基因如FXR mRNA表達(dá)下調(diào)

17、(P＜0.05); CYP7A1和CYP781 mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，CYP7A1蛋白表達(dá)也明顯增加。
　　1.7宏基因組測序結(jié)果顯示，NPC1L1基因敲除介導(dǎo)的腸道膽固醇吸收抑制在高脂飲食條件下能夠顯著改變腸道菌群的組成。
　　2.巨噬細(xì)胞脂質(zhì)分解在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用研究
　　2.1 ox-LDL刺激下THP-1細(xì)胞中CGI-58蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)，ox-LDL刺激原代巨噬細(xì)胞后，腹腔和骨髓

18、巨噬細(xì)胞內(nèi)CGI-58的表達(dá)也明顯下降，以腹腔巨噬細(xì)胞改變更為明顯。對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行熒光染色后發(fā)現(xiàn)，空白刺激情況下巨噬細(xì)胞CGI-58敲除后較未敲除組脂滴聚集增多，ox-LDL刺激下，未敲除CGI-58的細(xì)胞脂滴聚集增加，巨噬細(xì)胞CGI-58敲除后，脂滴聚集更為明顯。
　　2.2通過條件性基因打靶技術(shù)建立了巨噬細(xì)胞CGI-58和ApoE敲除小鼠模型，其基因型為ApoE-/-CGI-58f/f/cre+(DKO)。DKO小鼠與

19、對照鼠相比，體重增加和生育能力正常。通過檢測血漿中膽固醇及脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)，西方飲食飼喂6周后，DKO小鼠相較對照組(ApoE-/-CGI-58f/f)小鼠血漿膽固醇和甘油三酯含量明顯增高(P＜0.01)。初步結(jié)果顯示，DKO主動(dòng)脈斑塊數(shù)量較對照組有所增加。
　　2.3 DKO相較ApoE-/-和WT小鼠糖耐量降低(P＜0.05)，胰島素抵抗明顯增加(P＜0.05)，提示巨噬細(xì)胞CGI-58可能也參與了全身血糖代謝調(diào)節(jié)，但與動(dòng)脈粥

20、樣硬化的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。
　　結(jié)論：
　　1.腸道菌群可能是體內(nèi)膽固醇平衡調(diào)節(jié)的重要組成部分。
　　2.腸道菌群可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，增加腸道膽固醇重吸收，有效的防止體內(nèi)膽固醇的大量流失。
　　3.厚壁菌門和擬桿菌門細(xì)菌的改變可能與NPC1L1調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)。
　　4.動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因子ox-LDL能夠降低巨噬細(xì)胞內(nèi)的CGI-58表達(dá)，同時(shí)巨噬細(xì)胞CGI-58可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因子刺激