A族鏈球菌M蛋白在誘導(dǎo)巨噬細胞活化及調(diào)節(jié)中的作用.pdf

1、目的:
　　 A族鏈球菌(GroupAstreptococcus，GAS)是一種以人類為唯一宿主的細菌，感染后若治療不及時可引發(fā)多種嚴重的疾病。本室在GAS致炎機制及免疫逃逸方面做了大量工作。M蛋白位于GAS的表面，是它的主要的毒力因子，研究顯示M蛋白有著較強的致炎能力，且有助于GAS逃避巨噬細胞的吞噬。結(jié)合本室前期工作，本課題對M蛋白在誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)巨噬細胞活化方面做繼續(xù)研究。
　　 巨噬細胞是機體重要的效應(yīng)細胞，活化的巨

2、噬細胞可以分泌促炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些因子在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。炎癥的發(fā)展過程中受許多負調(diào)控因子的作用，我們對腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(A20)予以了特別的關(guān)注，A20是炎癥信號傳導(dǎo)的中心——轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制因子，而M蛋白對A20的誘導(dǎo)產(chǎn)生，發(fā)揮作用有著怎樣的影響？同時IL-10是一種強烈的抑制單核巨噬細胞分泌炎癥因子的細胞因子，在巨噬細胞受到M蛋白刺激時它的表達情況如何？細胞因

3、子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子(SOCS)是細胞信號JAK/STAT通路以及MYD88/NF-κB通路的負調(diào)控因子，在M蛋白所致巨噬細胞炎癥發(fā)展過程中它的表達量如何？對于以上疑問，本課題旨在做初步研究。因此，在本研究中我們首先表達了M蛋白，同時構(gòu)建并表達另一種由GAS分泌的蛋白SpeB作為對照蛋白，通過對比兩種蛋白分別刺激巨噬細胞后的促炎細胞因子及相關(guān)負調(diào)控因子的表達情況來驗證M蛋白是否與其他GAS相關(guān)蛋白在促進炎癥以及表達負調(diào)控因子方面是否存在差異

4、，以期為今后在M蛋白誘導(dǎo)巨噬細胞負調(diào)控因子表達方面更深入的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 通過以上工作，旨在深化對于GAS的認識，以期為臨床更精確的靶向治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、目的蛋白制備:將本室已有的含有M蛋白表達質(zhì)粒pEGX2-T的貯存菌DH-5α提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染表達菌E.coliBL21，用IPTG誘導(dǎo)表達M蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，純化，定量。構(gòu)建SpeB蛋白的表達質(zhì)粒pET28a-SpeB

5、，轉(zhuǎn)染表達菌E.coliBL21后表達蛋白，純化，定量。
　　 2、細胞毒性試驗以及蛋白作用濃度的選擇:首先MTT法檢測M蛋白和SpeB蛋白的細胞毒性，鱟試劑盒檢測融合蛋白LPS含量，然后參考以0.1、1、5、10μg/ml濃度的M蛋白作用于巨噬細胞RAW264.7后A20的表達情況，以確定適合刺激濃度。
　　 3、以PBS為陰性對照，以LPS為陽性對照(用量10ng/μl)，M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264.7

6、細胞后細胞因子的表達:以10μg/ml濃度的M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264.7細胞2、4、8、12小時后行Realtime-PCR檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及負調(diào)控因子A20、IL-10、SOCS1和SOCS3的mRNA表達水平。
　　 4、M蛋白刺激RAW264.7細胞后A20、P65及TRAF6的表達:以10μg/ml濃度的M蛋白刺激RAW264.7細胞4、8、12、24小時后Westernbl

7、ot檢測P65，A20及其下游分子TRAF6。
　　 5、M蛋白刺激C57小鼠BMDM細胞后A20、P65及TRAF6的表達:以10μg/ml濃度的M蛋白刺激小鼠BMDM細胞4、8、12、24小時后Westernblot檢測P65，A20及其下游分子TRAF6。
　　 結(jié)果:
　　 1、表達并純化M蛋白，蛋白定量濃度為160μg/ml。構(gòu)建、表達、并純化SpeB蛋白，蛋白定量75μg/ml。
　　 2、經(jīng)

8、MTT檢測顯示M蛋白濃度小于20μg/ml的時候?qū)毎麩o毒性，LPS含量為1.015ng/μl;SpeB蛋白小于16μg/ml的時候?qū)毎麩o毒性，LPS含量為0.786ng/μl。確定以10μg/ml作為蛋白作用濃度。
　　 3、M蛋白刺激RAW264.7細胞2、4、8、12小時后行Realtime-PCR檢測結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6各細胞因子較對照均表達增高，多個時間點有顯著性差異(P＜0.05)。其中IL-1

9、β和IL-6較TNF-α增高明顯，在8小時左右達峰值。負調(diào)控因子方面A20表達增高明顯，在4小時左右達到高峰，與對照相比，除4小時外皆有顯著性差異(P＜0.05)。IL-10、SOCS1和SOCS3均有不同程度增高。同時用SpeB蛋白做平行實驗，結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6各細胞因子較對照均表達增高，但相對低于M蛋白刺激后的結(jié)果，而負調(diào)控因子A20、SOCS1和SOCS3的表達顯著低于M蛋白刺激后的結(jié)果，IL-10的表達更是

10、低于正常對照。
　　 4、M蛋白刺激RAW264.7細胞4、8、12、24小時后經(jīng)Westernblot檢測顯示A20表達量在12小時以前呈逐漸增高，24小時A20的表達與12小時比較是降低的。M蛋白刺激RAW264.7細胞4、8、12、24小時后行Westernblot檢測P65和TRAF6結(jié)果顯示P65表達增高明顯且在24小時以內(nèi)持續(xù)增高，表明NF-κB通路處于被激活的狀態(tài)，而TRAF6的表達量在24小時內(nèi)呈動態(tài)變化，即8小

11、時和24小時的變化量要分別低于4小時和12小時。
　　 5、M蛋白相同條件刺激BMDM細胞4、8、12、24小時行Westernblot檢測A20結(jié)果顯示A20在12小時以內(nèi)的表達量逐漸增高，24小時后的表達量低于12小時;P65的表達在24小時內(nèi)是逐漸增高的而TRAF6的變化趨勢與RAW264.7細胞相同。
　　 結(jié)論:
　　 1、M蛋白和SpeB蛋白均能促進巨噬細胞分泌促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF