百脈根共生信號(hào)途徑中CASTOR及其相互作用蛋白的研究.pdf

1、CASTOR編碼百脈根(Lotusjaponicus)中的離子通道蛋白，它是共生途徑上的功能基因，作用于結(jié)瘤因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的鈣離子激增(calcium spiking)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游，突變后不能形成根瘤。 為了進(jìn)一步揭示CASTOR調(diào)控共生信號(hào)途徑的分子機(jī)制，本文構(gòu)建了百脈根的cDNA文庫(kù)，并通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)在百脈根的cDNA文庫(kù)中篩選可能與CASTOR相互作用的蛋白。 以接種根瘤菌(Mesorhizobium lo

2、ti)后2，4，8，12d的百脈根植株為材料提取總RNA，按照酵母雙雜交試劑盒提供的方法構(gòu)建百脈根的cDNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建后經(jīng)有限稀釋法測(cè)定的cDNA文庫(kù)效率為2×10<'6>個(gè)轉(zhuǎn)化子/3ug pGADT7-Rec。菌落PCR顯示文庫(kù)的eDNA片段大部分在500bp至2kb之間，文庫(kù)構(gòu)建較成功而且無(wú)污染。 成功構(gòu)建了CASTOR-RCK-BD重組質(zhì)粒，并以其為誘餌篩選百脈根的cDNA3文庫(kù)。初篩獲得111個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)x-Gal

3、檢測(cè)以及回轉(zhuǎn)酵母驗(yàn)證進(jìn)一步確認(rèn)有99個(gè)藍(lán)色克隆子，測(cè)序以及NCBI BLASTk對(duì)分析鑒定JAB1、clpA、鈣調(diào)素結(jié)合的翻譯延伸因子等7種可能與CASTOR相互作用的蛋白。其中陽(yáng)性克隆中鈣調(diào)素結(jié)合的翻譯延伸因子的數(shù)目最多，占總數(shù)的30％以上，而且蛋白的同源性也達(dá)到了90％，經(jīng)DNAMAN等軟件分析發(fā)現(xiàn)它們可以分為5類。 利用RT-PCR方法檢測(cè)了這些基因在接種以及不接種根瘤菌的百脈根中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示鈣調(diào)素結(jié)合的翻譯延伸因