KRAS信號(hào)通路蛋白相互作用的雙分子熒光互補(bǔ)成像研究及其優(yōu)化.pdf

1、雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC)技術(shù)是指通過具有相互作用親和力的兩個(gè)蛋白質(zhì)，將分別與其相連的熒光蛋白片段拉近，組裝成完整的熒光蛋白，從而表征蛋白質(zhì)相互作用的發(fā)生及其空間位置。由于BiFC技術(shù)檢測靈敏度高、操作簡便直觀，已成為活細(xì)胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。但該方法具有假陽性率高、結(jié)合反應(yīng)不可逆等缺點(diǎn)，使其在蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)與量化研究應(yīng)用中受到限制。

2、本文對(duì)不同理化特點(diǎn)的BiFC系統(tǒng)進(jìn)行了比較與探討，并通過選擇合適的表達(dá)載體和熒光蛋白片段構(gòu)建了一個(gè)能顯著降低假陽性的BiFC體系，進(jìn)而用不同的BiFC系統(tǒng)對(duì)K-Ras信號(hào)通路中的上下游蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行了研究，研究成果如下：
　　對(duì)不同BiFC體系的效率與特點(diǎn)進(jìn)行了比較；同時(shí)利用基于黃色熒光蛋白突變體Venus的N端1-172（Vn173）和C端155-238（Vc155）組成的BiFC體系對(duì)上皮生長因子受體（Epidermal

3、Growth Factor Receptor, EGFR）二聚化作用在多種細(xì)胞中進(jìn)行了觀察和分析。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了基于Vn173/Vc155的真核雙表達(dá)載體，把BiFC體系簡化成每個(gè)載體中含有兩個(gè)蛋白的基因序列；進(jìn)而利用該體系，分別對(duì)KRAS(Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因同源基因產(chǎn)物)/RAF1（RAF原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）、KRAS/RASSF2（Ras-association domain family2）和KRA

4、S/GRB2（生長因子受體結(jié)合蛋白2，Growth factor receptor-bound protein2）的相互作用及其細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。通過對(duì)上述蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成的熒光復(fù)合體的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：在沒有EGF刺激的條件下，RAF1與KRAS間存在微弱的結(jié)合作用；在 RAF1定位于細(xì)胞膜上的過程中，KRAS與 RAF1間形成的復(fù)合體而不是 KRAS起著更為重要的作用；KRAS與GRB2能形成復(fù)合體，在這個(gè)過程中GRB2的兩

5、個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域與KRAS的結(jié)合能力較SH2結(jié)構(gòu)域強(qiáng)，在活細(xì)胞中證實(shí)了已有的理論，即GRB2同SOS1形成復(fù)合體后與KRAS結(jié)合并被募集到細(xì)胞膜上；RASSF2與KRAS能在細(xì)胞膜上結(jié)合，但RASSF2進(jìn)入細(xì)胞核的過程中KRAS沒有與之形成復(fù)合體；EGF的刺激或KRAS的活化明顯增強(qiáng)了以上三個(gè)蛋白與KRAS的相互作用中。在這些體系中，由于Vn173與Vc155隨機(jī)碰撞導(dǎo)致的本底結(jié)合作用，即使不存在相互作用的一對(duì)蛋白也可能產(chǎn)生BiFC熒光，

6、所以僅僅根據(jù)BiFC的結(jié)果無法確定兩個(gè)蛋白間是否存在相互作用。這限制了BiFC在蛋白相互作用檢測中的應(yīng)用。
　　為了克服BiFC的上述缺點(diǎn)，本論文通過使用一對(duì)新的BiFC熒光片段mLumin1-151（Ln）和mLumin152-231（Lc），在雙表達(dá)載體中構(gòu)建了新的BiFC體系，通過一對(duì)已知相互作用的蛋白對(duì) bFOS/bJUN及其失去相互作用的突變體（bΔFOS）/bJUN的BiFC效率的比較，證明該體系明顯降低了BiFC體系

7、中因非特異性結(jié)合而導(dǎo)致的假陽性。利用這個(gè)體系，對(duì) KRAS/GRB2的相互作用進(jìn)行了量化分析。結(jié)果顯示KRAS在活化前后與GRB2間形成的BiFC熒光變化比基于Venus的BiFC體系中更大，而KRAS的CAAX突變體與GRB2在這個(gè)體系中無法觀測到可見的熒光；這進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)體系降低假陽性的能力。通過對(duì)BiFC體系的比較，為我們提供了在不同目的的蛋白相互作用研究中對(duì)這些體系選擇的原則：以弱相互作用復(fù)合體的亞細(xì)胞定位觀察為目的的研究中

8、，更適于選擇具有更高靈敏度的Venus為基礎(chǔ)的BiFC體系；在最佳生長溫度低于30oC的生物體進(jìn)行BiFC觀察時(shí)，基于GFP的BiFC體系將是更好的選擇；而對(duì)于需要量化分析蛋白質(zhì)的相互作用，尤其是判定未知蛋白質(zhì)之間是否發(fā)現(xiàn)相互作用時(shí)，基于mLumin的雙表達(dá)載體具有更大的優(yōu)勢。
　　總之，本論文建立了一個(gè)基于mLumin的雙表達(dá)載體的BiFC體系，該體系很大程度上降低了BiFC的假陽性率；利用不同的BiFC體系，對(duì)KRAS信號(hào)通路