朊蛋白與信號蛋白14-3-3β相互作用的研究.pdf

1、目的：朊病毒病（prion disease）是一類罕見的致死性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其致病因子朊病毒是一種可以自我復(fù)制的蛋白，其毒性區(qū)域在第106-126位氨基酸，主要存在于腦神經(jīng)細(xì)胞中；14-3-3β蛋白是哺乳動物體內(nèi)普遍存在的一種蛋白，主要存在于腦神經(jīng)細(xì)胞中，具有信號傳導(dǎo)和保護(hù)功能。我們的研究目的就是希望通過正常的朊蛋白與14-3-3β蛋白之間是否發(fā)生相互作用以及確定作用的區(qū)域來了解14-3-3β蛋白在克雅氏病的發(fā)病過程中的可能機制。

2、 方法：我們首先將表達(dá)實驗中使用的朊蛋白基因序列和14-3-3β蛋白基因序列進(jìn)行構(gòu)建并表達(dá)蛋白；再分別在體外和細(xì)胞水平，利用免疫共沉淀、pull down和能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）實驗檢測朊蛋白與人14-3-3β蛋白是否發(fā)生分子間的相互作用及相互作用的部位。 結(jié)果：我們先將一組重組的朊蛋白（包含有朊蛋白的106-126位氨基酸）與重組的14-3-3β蛋白分別進(jìn)行免疫共沉淀實驗和pull down實驗；其次我們又分別用重組

3、的朊蛋白與天然的14-3-3β蛋白和天然的朊蛋白與重組的14-3-3β蛋白分別進(jìn)行pull down實驗；接著我們將天然的朊蛋白與天然的14-3-3β蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實驗。但是為了確定兩者相互作用的區(qū)域，我們接著將另一組重組朊蛋白（部分包含朊蛋白106-126位氨基酸）與重組的14-3-3β蛋白進(jìn)行了免疫共沉淀實驗。同時為了研究朊蛋白與14-3-3β蛋白在細(xì)胞水平是否相互作用，我們先將沒有信號肽的朊蛋白（PrP23-231）轉(zhuǎn)染HeL

4、a細(xì)胞，使得朊蛋白在胞漿中表達(dá)，并分別使用兩種蛋白抗體孵育，再分別加入FITC標(biāo)記的抗鼠二抗和Rodamine標(biāo)記的抗兔二抗孵育，進(jìn)一步處理后鏡下觀察。 結(jié)論：通過以上實驗我們得到二條重要結(jié)論，其一是朊蛋白可以與14-3-3β蛋白在體外和細(xì)胞水平均可以發(fā)生相互作用，其二是朊蛋白與14-3-3β蛋白發(fā)生相互作用的區(qū)域在朊蛋白的106-126位氨基酸。而朊蛋白的毒性區(qū)域在氨基酸序列的第106-126位。因此14-3-3β蛋白是否通過