杉木14-3-3蛋白介導(dǎo)根系應(yīng)答水分脅迫的研究.pdf

1、杉木是我國特有的速生用材樹種，單產(chǎn)高，用途廣,分布遍及我國南方16省(區(qū))。受夏季太平洋副熱帶高壓的影響，我國南方杉木人工林主產(chǎn)區(qū)季節(jié)性伏旱和秋旱頻繁，嚴(yán)重制約著杉木林生長及南方林業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。根系是植物與根際環(huán)境“交流”的首要門戶，在長期進(jìn)化過程中，根系形成完善的生長機(jī)制來應(yīng)答水分脅迫，但對其復(fù)雜的調(diào)控過程仍有諸多未知。本研究以杉木根系為材料，利用雙向電泳-質(zhì)譜分離的方法鑒定出杉木根系在PEG模擬水分脅迫下的差異響應(yīng)蛋白，并從中發(fā)現(xiàn)植

2、物中廣泛參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的14-3-3蛋白，推測其可能作為重要的調(diào)控因子參與杉木根系答水分脅迫?；趯嶒炇仪捌诳寺〕龅纳寄?4-3-3基因家族不同成員的cDNA全長序列，對其中兩個14-3-3基因進(jìn)行在大腸桿菌原核表達(dá)分析，并構(gòu)建植物過表達(dá)載體，之后對野生型擬南芥材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，探索杉木根系14-3-3蛋白在根系響應(yīng)水分脅迫過程中扮演的角色。主要研究結(jié)果如下：
　　1、利用雙向電泳技術(shù)，研究了PEG模擬水分脅迫下，杉木無性系根系蛋白

3、質(zhì)差異表達(dá)情況，選取20個具有統(tǒng)計意義的蛋白點，對這些蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，成功鑒定了11個蛋白點，主要分為6大類，分別為：參與植物體內(nèi)氧化還原平衡、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)、能量代謝、光合作用相關(guān)蛋白及其他功能未知蛋白，其中包含在植物中廣泛參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的14-3-3蛋白。
　　2、通過設(shè)計帶酶切位點的基因特異引物，分離克隆杉木14-3-3-0,14-3-3-4兩個不同家族成員的cDNA全長序列，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體 pET32a-14

4、-3-3-0, pET32a-14-3-3-4，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，14-3-3編碼的蛋白可在大腸桿菌中高效表達(dá)，利用SDS-PAGE的方法也檢測到分子量約為31kD的目的蛋白，與預(yù)測的蛋白分子量相符。
　　3、分別克隆出不帶終止密碼子的14-3-3-0,14-3-3-4基因，將其構(gòu)建到由花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子誘導(dǎo)的植物表達(dá)載體pTEV7上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥植株，卡那霉素抗性

5、篩選與PCR檢測顯示獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性株，經(jīng)過篩選、培養(yǎng)、鑒定，我們獲得1個轉(zhuǎn)14-3-3-0基因擬南芥純和系，2個轉(zhuǎn)14-3-3-4基因擬南芥純和系。
　　4、RT-PCR結(jié)果表明，杉木14-3-3基因整合到擬南芥基因組中并成功表達(dá)。利用目的基因與GFP融合蛋白共定位技術(shù)研究了杉木14-3-3蛋白的亞細(xì)胞定位。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，在根尖成熟區(qū)獲得清晰的視野，杉木14-3-3蛋白主要定位于細(xì)胞核中。在甘露醇模擬水分脅迫下，