蛋白質(zhì)組學解析TLR2的天然免疫應答和TNF-α刺激的14-3-3蛋白復合物的研究.pdf

1、本論文主要以質(zhì)譜為基礎的細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定同位素標記技術作為蛋白質(zhì)組學研究的定量技術平臺，詳細研究了特異性激動劑引起的巨噬細胞TLR2的天然免疫應答和腫瘤壞死因子刺激下14-3-3 epsilon蛋白復合物的組成變化情況；同時與傳統(tǒng)的酶解方法不同，本文也嘗試了用微流控芯片技術來固定蛋白酶，實現(xiàn)了復雜的實際樣品的快速、高效酶解，并與傳統(tǒng)的酶解方法進行了比較。
　　 論文的第一章綜述了近年來定量蛋白質(zhì)組學在方法上、技術上及應用方面的研究

2、進展以及蛋白質(zhì)相互作用技術在生物學上的進展，特別強調(diào)了目前應用比較廣泛的氨基酸同位素標記的定量蛋白質(zhì)組學和蛋白質(zhì)相互作用組學；指出了各種方法的優(yōu)缺點及應用，并由此引出了本論文的研究背景；文中最后闡述了本論文的研究目的和意義。
　　 論文的研究工作主要分三章，第一章涉及的是亞細胞組分的免疫細胞的天然免疫應答；第二章研究的是蛋白復合物的相互作用組；第三章研究的是微流控芯片的實際樣品酶解。下面將詳細介紹各章內(nèi)容：
　　 (一)

3、蛋白質(zhì)組學解析特異性激動劑引起的巨噬細胞TLR的天然免疫應答
　　 用不同的細菌、病毒或激動劑進行刺激，抗原遞呈細胞包括巨噬細胞，能夠表達不同的Toll樣受體(Toll-like receptor)，通過信號傳導途徑，產(chǎn)生天然免疫應答，調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子活性和特定基因的表達。重要的是，這些炎癥信號最終靶向染色質(zhì)，引起基因表達的改變。為了深入理解特異性激動劑引起的調(diào)控機理，在亞細胞組分水平上，我們分析了一個已知的TLR2激動劑-Pa

4、m3CSK4所引起的活的巨噬細胞的蛋白質(zhì)組變化，利用穩(wěn)定同位素標記的定量蛋白質(zhì)組學方法鑒定了胞漿部分和染色質(zhì)相關部分差異表達的蛋白?？偣茶b定了1000多個蛋白，其中定量了540個蛋白，大約1/2的蛋白發(fā)生了差異表達，并采用WB進行了部分蛋白如FHC、HSP90β、HSP70、14-3-3e、RS6和NF-κBp100等的驗證，其結果與質(zhì)譜鑒定的定量結果一致；同時，對鑒定到的兩部分蛋白進行了功能分類和討論，發(fā)現(xiàn)對于S1組分，差異表達的蛋白

5、主要參與了翻譯后修飾活動、能量代謝、蛋白轉(zhuǎn)運和細胞死亡等生物學活動；而對于P3鑒定的蛋白，我們借助于生物信息學工具，繪制了鑒定到的核蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡圖，通過對這些蛋白的功能分析，我們發(fā)現(xiàn)TLR2激動劑刺激后差異表達的蛋白主要參與蛋白組-泛素化通路、DNA復制和修復、翻譯后等生物學過程；最后我們將所得的Pam3CSK4刺激巨噬細胞的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)與今年Nature上(Nature，447，(7147)：972，2007)發(fā)表的LPS刺激

6、巨噬細胞的微陣列數(shù)據(jù)進行了比較，發(fā)現(xiàn)與前炎癥基因相關的一些蛋白其上調(diào)趨勢是一致的，而與抗微生物基因相關的蛋白其表達變化是不一致的，這進一步說明了不同的TLRs激動劑引起的天然免疫應答的特異性。本章的工作從整體上對TLR激動劑引起的全蛋白的表達變化進行了研究，這一結果將有助于系統(tǒng)了解TLR的信號通路，特別是對與TLR相關的免疫性疾病的診斷、治療、預防等具有重要的指導意義。
　　 (二)TNF-α引起的14-3-3 epsilon蛋

7、白復合物的變化
　　 14-3-3蛋白是一種高度保守的酸性可溶性蛋白，現(xiàn)有的研究表明：14-3-3蛋白通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多個信號轉(zhuǎn)導通路而參與多種細胞生命活動的調(diào)控，涉及細胞凋亡、生長、增殖、信號轉(zhuǎn)導等，為多功能蛋白。而腫瘤壞死因子(tumor necrosisfactor，TNF)是迄今發(fā)現(xiàn)的直接殺傷惡性腫瘤作用最強的生物活性因子，可以通過不同的信號途徑導致細胞的生長或凋亡，其中一個很重要的發(fā)現(xiàn)就是其可以激發(fā)MAP3K信號途徑，招

8、募14-3-3蛋白，導致NF-κB信號通路的活化。本章采用氨基酸同位素代謝標記和表位標記的雙標記策略，以穩(wěn)定表達帶有標簽的14-3-3 epsilon的大量293T細胞為研究對象，采用免疫共沉淀的實驗方法，研究了TNF-α刺激下特定的14-3-3ε蛋白的相互作用。表位標記的方法可以提高免疫沉淀效率，增加蛋白復合物鑒定的幾率；而以質(zhì)譜為基礎的氨基酸同位素代謝標記的定量方法可以有效去除非特異性結合蛋白。借助這種策略，除了靶蛋白外，我們還鑒定

9、到了包括已知相互作用的蛋白如CDC-37、HSP90、TAK1、TBK1等在內(nèi)的55個相互作用的蛋白。許多未經(jīng)報道的蛋白，如DDX21、RuvBL2、PPM1B、核糖體蛋白等被首次報道，并對鑒定到的蛋白進行了WB驗證和生物學功能分類分析。我們先選擇已知的相互作用蛋白如HSP90、TAK1、TBK1做WB，驗證方法的準確性、可行性，其WB結果與實驗結果一致；然后我們又選取了未報道的相互作用蛋白如DDX21、RuvBL2、PPM1B，做進一

10、步驗證，WB結果也與實驗結果一致。與此同時，我們還比較了刺激前后14-3-3ε蛋白復合物的變化情況，發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激前，鑒定到的蛋白主要參與信號傳導、RNA結合、蛋白折疊、氧化還原調(diào)節(jié)、壓力應答、細胞骨架等生物學活動；而TNF-α刺激后，鑒定到有些蛋白參與了TNF信號通路和NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控活化，這一結果說明了TNF-α的特異性刺激。本章的研究結果將對理解細胞內(nèi)蛋白或信號轉(zhuǎn)導相互作用的網(wǎng)絡具有重大意義。同時14-3-3蛋白與多種疾病有

11、關，深入認識14-3-3蛋白可能為治療一些疾病開辟新思路。
　　 (三)微流控反應器在復雜蛋白樣品的酶解
　　 前面幾章研究的蛋白差異表達譜和蛋白相互作用表達譜均采用的是膠上酶解的傳統(tǒng)方法，我們還與Dr.Liu研究小組合作，嘗試了用微流控芯片反應器作為酶解實際蛋白樣品的平臺。首先我們用納米金膠多層膜組裝的微流控反應器酶解從小鼠巨噬細胞中提取的水溶性蛋白，將酶解產(chǎn)物用兩維液相色譜與Qstar質(zhì)譜聯(lián)用的技術進行分離鑒定，并與

12、傳統(tǒng)的溶液酶解結果進行比較，發(fā)現(xiàn)芯片法和溶液酶解法鑒定到的蛋白分別是194和170個，顯然，兩者之間的結果是可比的，值得一提的是，芯片法酶解快速，幾秒鐘即可完成酶解，更具優(yōu)勢。
　　 我們還研究了納米金膠多層膜組裝的微流控反應器酶解從巨噬細胞中提取的全蛋白，一次實驗即鑒定了497個蛋白，并與膠上酶解鑒定到的蛋白結果進行了比較，發(fā)現(xiàn)此種微流控芯片反應器完全可以應用于實際復雜樣品的酶解；但是由于不同的提取蛋白試劑或采用不同的質(zhì)譜鑒定