百脈根結(jié)瘤因子受體NFR5及其相互作用蛋白的研究.pdf

1、在豆科植物中，結(jié)瘤因子作為根瘤菌共生信號分子作用于寄主植物，植物中的結(jié)瘤因子受體NFR1和NFR5共同參與接受結(jié)瘤因子信號，并與之相結(jié)合，然后依次將結(jié)瘤因子信號傳遞到下游調(diào)控結(jié)瘤基因，從而引起植物細(xì)胞一系列形態(tài)、生理及生化變化。同時也完成了寄主植物與根瘤菌早期分子對話和信號傳遞。本研究希望能在豆科植物百脈根中發(fā)現(xiàn)與豆科植物結(jié)瘤因子受體NFR5相互作用的蛋白質(zhì)，從而進(jìn)一步揭示NFR5的功能以及根瘤菌與植物共生固氮的信號途徑。本研究包括兩部

2、分內(nèi)容，主要內(nèi)容如下： 1)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與結(jié)瘤因子受體NFR5相互作用的蛋白以豆科植物百脈根的mRNA為模板，通過RT-PCR，擴(kuò)增到1.0kb結(jié)瘤因子受體5(nod factor receptor NFR5)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的DNA片段(nfr5-pk)，并將該片段克隆到酵母雙雜交BD載體pGBKT7上。通過酵母雙雜技術(shù)，篩選接種根瘤菌的百脈根AD-cDNA酵母雙雜交文庫。結(jié)果從文庫中分離到與nfr5-pk相互作用的22

3、1個陽性克隆，經(jīng)從這些陽性克隆酵母中分離AD質(zhì)粒反復(fù)驗(yàn)證后，對26個確定陽性克隆的外源片段進(jìn)行測序和同源性分析。通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析鑒定出小G蛋白ROP6等六個與NFR5-PK相互作用的不同基因，其結(jié)果為進(jìn)一步研究NFR5基因的功能和調(diào)控機(jī)制提供材料。 2)百脈根小G蛋白：ROP6與根瘤菌結(jié)瘤因子識別和信號傳導(dǎo)相關(guān)性的鑒定和分析以酵母雙雜交篩選得到的pGADT7-ROP6質(zhì)粒為模板，構(gòu)建pTYB12-ROP6重組載體；將重

4、組表達(dá)載體pTYB12-ROP6轉(zhuǎn)化到EcoiLER2566菌株中，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CBD-ROP6融合蛋白，用Chimin beMs進(jìn)行純化，待用于體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。 小G蛋白ROP6能與NFR5相互作用，說明它可能參與結(jié)瘤因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。分別收集接種根瘤菌后第2，4，6，8天百脈根的根，同時收集未接種根瘤菌百脈根的根，分別抽提的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果說明，ROP6在未接種根瘤菌的植株中表達(dá)量很低，在接種根瘤