2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、根瘤菌能與豆科植物特異的形成根瘤,植物通過(guò)光合作用為根瘤菌提供碳源,根瘤菌含有的固氮酶將空氣中的氮還原從而為植物提供氮源。根瘤的發(fā)生起始于植物分泌的一種類黃酮化合物信號(hào)分子,這種信號(hào)分子作用于根瘤菌,促使根瘤菌分泌結(jié)瘤因子(Nod factor),結(jié)瘤因子作為根瘤菌共生信號(hào)分子作用于寄主植物,引起植物一系列形態(tài)、生理生化變化而產(chǎn)生根瘤。結(jié)瘤因子受體1(Nod factor receptor1,NFR1)是從百脈根不結(jié)瘤突變株中分離得到的

2、基因,它負(fù)責(zé)接受結(jié)瘤因子并將信號(hào)向下傳遞。NFR1的蛋白包括3個(gè)部分:N-端的膜外部分含有2個(gè)Lys-M結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)結(jié)瘤因子的接受,中間含有跨膜結(jié)構(gòu)(TM),C-端的膜內(nèi)部分含有磷酸激酶(Protein kinase)結(jié)構(gòu)域。NFR1自發(fā)現(xiàn)以來(lái),其下游的信號(hào)接收分子仍未探明。酵母雙雜交是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)研究蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù),常用于蛋白之間作用的體內(nèi)鑒定。為了弄清NFR1下游的信號(hào)流向,進(jìn)一步闡明結(jié)瘤因子信號(hào)傳遞途徑,我們構(gòu)建了一個(gè)

3、百脈根AD-cDNA文庫(kù),通過(guò)酵母雙雜交技術(shù),以NFR1為誘餌,在文庫(kù)中找尋與NFR1相互作用的蛋白,為確定NFR1的信號(hào)傳遞相關(guān)基因提供候選者。 貧栽培養(yǎng)百脈根,接種后分2d,4d,6d,8d,12d分別收獲根部組織。將收獲的根部組織混合,提取總RNA。通過(guò)RT-PCR得到cDNA,在cDNA兩端加上接頭,與帶有接頭的線性化的質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109,帶有接頭的cDNA和pGADT7-Rec在酵母細(xì)胞內(nèi)

4、通過(guò)同源重組而成環(huán)化質(zhì)粒,cDNA插入片斷整合到GAL4 AD之后,在酵母體內(nèi)與GAL4 AD融合表達(dá)。在SD/-Leu培養(yǎng)基上篩選文庫(kù)轉(zhuǎn)化子,待轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)出5d后,以Freezing Medium(含25%(v/v)甘油的YPD)收集所有轉(zhuǎn)化子,并分裝為1ml/管,于-70℃保存。通過(guò)稀釋平板計(jì)數(shù),計(jì)算得到文庫(kù)效率約為2×10<'6>,達(dá)到了每3ug pGADT7-Rec質(zhì)粒一百萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)化子的期望值.隨機(jī)挑選部分文庫(kù)菌落抽取質(zhì)粒,以為A

5、D Insert Screening引物做PCR,檢查文庫(kù)的空載率以及插入片斷平均長(zhǎng)度,空載率為12.5%,平均片段長(zhǎng)度在1.5kb左右。通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),所得文庫(kù)的細(xì)胞濃度為2×10<'7>個(gè)/ml,達(dá)到了酵母雙雜交所需要的細(xì)胞濃度。 將NFR1的膜內(nèi)激酶區(qū)域克隆到pGBKT7上作為誘餌質(zhì)粒,再將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187。將含有誘餌質(zhì)粒的Y187與文庫(kù)菌AH109混合培養(yǎng),Y187與AH109交配融合,通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)

6、,在四缺培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。初步篩選得到了120個(gè)克隆,將初篩得到的克隆在含X-Gal(80μg/ml)的四缺平板上復(fù)篩,得到80個(gè)變藍(lán)的克隆,初步確定變藍(lán)的菌落為陽(yáng)性克隆。從陽(yáng)性克隆中分離出AD質(zhì)粒,以AD質(zhì)粒為模版PCR擴(kuò)增cDNA插入片斷。將AD質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NFR1PK共轉(zhuǎn)化AH109,進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。挑選部分克隆測(cè)序,得到數(shù)種未知基因。以2d,4d,6d,8d,未接種的百脈根根部和百脈根葉,莖提取RNA,通過(guò)稀釋

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