CREB信號(hào)途徑介導(dǎo)Ops致認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制.pdf

1、目前農(nóng)藥已經(jīng)成為人們提高農(nóng)作物產(chǎn)量和日常生活殺蟲的必需品，有機(jī)磷殺蟲劑(Organophosphorus pesticides，OPs)因其經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)，逐漸成為目前應(yīng)用最多的殺蟲劑。OPs在全球范圍內(nèi)的大量使用，勢(shì)必對(duì)環(huán)境造成持續(xù)的污染，這種長(zhǎng)期、低劑量的OPs暴露對(duì)人類健康的威脅值得關(guān)注。
　　 流行病學(xué)調(diào)查顯示OPs暴露人群出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙，且學(xué)習(xí)記憶能力的下降出現(xiàn)在OPs暴露后的一段時(shí)間。而目前關(guān)于OPs長(zhǎng)

2、期低劑量染毒對(duì)動(dòng)物認(rèn)知功能影響的試驗(yàn)研究并不多見，其研究結(jié)果并不一致，且大多數(shù)體內(nèi)研究水平還停留在對(duì)現(xiàn)象的描述階段。因此，長(zhǎng)期、低劑量OPs暴露對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
　　 毒死蜱（Chlorpyrifos，CPF）是一種廣譜、高效、低毒的OPs，由于其嚴(yán)重的發(fā)育毒性，美國(guó)已經(jīng)在2002年禁止CPF在家庭殺蟲中應(yīng)用，但目前CPF仍然大量應(yīng)用于全世界的農(nóng)作物殺蟲，是全球使用量最多的OPs之一。CPF是我國(guó)

3、2007年以后推薦的對(duì)硫磷、甲胺磷等禁用高毒OPs的替代品之一，也是我國(guó)農(nóng)副產(chǎn)品中經(jīng)常檢測(cè)出的主要?dú)埩艮r(nóng)藥和超標(biāo)農(nóng)藥，因此研究CPF長(zhǎng)期低劑量暴露對(duì)認(rèn)知功能的影響具有重要意義。
　　 由于海馬體在學(xué)習(xí)記憶，尤其是空間學(xué)習(xí)記憶功能中的重要作用，海馬體已經(jīng)成為研究空間學(xué)習(xí)記憶這一高級(jí)認(rèn)知功能的重要手段。本研究以CPF為受試物，選擇不引起動(dòng)物出現(xiàn)有機(jī)磷全身中毒癥狀的低劑量(1、5、10mg/kg)，對(duì)雄性Wistar大鼠施以連續(xù)12周

4、的灌胃染毒，圍繞海馬在空間學(xué)習(xí)記憶中的作用，利用Moms水迷宮、自發(fā)行為和抓力測(cè)試檢測(cè)CPF低劑量重復(fù)染毒對(duì)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能的影響，尤其是空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響，采用免疫組化、免疫熒光和蛋白印記等方法檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路的變化，探討CPF低劑量重復(fù)染毒致認(rèn)知功能障礙的可能作用機(jī)制。
　　 經(jīng)過(guò)12周CPF連續(xù)染毒，動(dòng)物的體重、攝食量沒有明顯改變，試驗(yàn)過(guò)程中也沒有觀察到流涎、肌肉振顫、腹瀉等明顯的有機(jī)磷中毒癥狀，而Morris

5、水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示染毒動(dòng)物到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）明顯延長(zhǎng)，而游泳速度也出現(xiàn)降低趨勢(shì)；為探討潛伏期的延長(zhǎng)原因，進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物進(jìn)行連續(xù)3天的可視平臺(tái)訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)染毒動(dòng)物的潛伏期和游泳速度與對(duì)照組相比沒有明顯改變，訓(xùn)練后立即利用Moms水迷宮再次進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的潛伏期和游泳速度均沒有明顯改變，上述結(jié)果表明CPF低劑量重復(fù)染毒能夠誘發(fā)大鼠長(zhǎng)時(shí)程空間記憶障礙，而對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)和短時(shí)程空間記憶能力沒有影響。而自發(fā)行為和抓力測(cè)試結(jié)果進(jìn)一步表明CPF染

6、毒后大鼠運(yùn)動(dòng)能力沒有明顯的影響，而動(dòng)物海馬的AChE活性檢測(cè)結(jié)果顯示10mg/kg劑量組出現(xiàn)輕度的AChE抑制(30％)，而1、5mg/kg劑量組沒有明顯改變，暗示CPF致長(zhǎng)時(shí)程空間記憶障礙存在著非膽堿能因素。
　　 海馬組織病理切片檢查發(fā)現(xiàn)CPF染毒動(dòng)物海馬的基本結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，但是細(xì)胞計(jì)量分析卻表明海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)減少。為進(jìn)一步分析海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的變化，利用特異的標(biāo)志物對(duì)海馬區(qū)幾種主要的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。NeuN是只在成熟神

7、經(jīng)元的胞核中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，western blot結(jié)果顯示染毒動(dòng)物海馬的NeuN蛋白表達(dá)產(chǎn)物不僅沒有減少，反而增加，而免疫組化結(jié)果則進(jìn)一步提示海馬齒狀回(DG)區(qū)NeuN陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)增加趨勢(shì)。β-3 tubulin(TUJl)和NF68是新生神經(jīng)元特異標(biāo)志物，western blot和免疫組化均證明CPF染毒動(dòng)物海馬的β-3tubulin、NF68表達(dá)明顯降低，而BrdU（神經(jīng)前體細(xì)胞）、GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞）的檢測(cè)也同樣出現(xiàn)劑量依

8、賴式減少。上述結(jié)果提示：CPF低劑量重復(fù)染毒能夠引起海馬區(qū)細(xì)胞構(gòu)成的改變，主要表現(xiàn)為新生神經(jīng)元減少，而成熟的神經(jīng)元卻沒有明顯變化。可見，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的減少并非是CPF的直接毒性作用，可能跟信號(hào)途徑的調(diào)控有關(guān)。而TUNEL免疫組化的凋亡細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)染毒動(dòng)物海馬凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2、p53以及caspase-3的檢測(cè)結(jié)果也未見明顯改變，說(shuō)明凋亡并非細(xì)胞減少的主要原因，上述結(jié)果表明：CPF重復(fù)染毒影響了海

9、馬的神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)。大量文獻(xiàn)確證成年動(dòng)物的海馬齒狀回（DG區(qū)）終身存在著神經(jīng)發(fā)生，而這些新生神經(jīng)細(xì)胞在海馬相關(guān)的空間記憶，尤其是長(zhǎng)時(shí)程記憶中起著非常重要的作用。可見，CPF低劑量重復(fù)染毒后動(dòng)物海馬新生神經(jīng)細(xì)胞的大量減少可能是其出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程空間記憶障礙的重要原因。
　　 成年動(dòng)物神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控是目前神經(jīng)生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，最新研究結(jié)果表明cAMP反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(CREB)在成年動(dòng)物的記憶存儲(chǔ)分配(MemoryA

10、llocation)中具有非常重要的作用，磷酸化的CREB可以活化其下游基因，促使其轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)海馬DG區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的神經(jīng)分化和促進(jìn)新生神經(jīng)元的存活與增殖，CREB活性的降低則導(dǎo)致新生神經(jīng)元的減少。而CREB信號(hào)通路的激活也是長(zhǎng)時(shí)程學(xué)習(xí)記憶能夠發(fā)生的關(guān)鍵，在學(xué)習(xí)記憶發(fā)生過(guò)程中，CREB的磷酸化蛋白表達(dá)增加。為探討CPF低劑量重復(fù)染毒后致長(zhǎng)時(shí)程空間記憶障礙的機(jī)制，對(duì)海馬CREB的磷酸化進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)染毒組動(dòng)物海馬CREB的磷酸化蛋白表

11、達(dá)明顯降低，而總CREB卻沒有明顯改變。
　　 CREB信號(hào)通路的激活主要受鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、蛋白質(zhì)激酶A(PKA)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)等激酶的調(diào)控。CaMKⅡ在空間學(xué)習(xí)與記憶和突觸可塑性中發(fā)揮著重要的作用，被認(rèn)為是記憶的分子開關(guān)；腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）依賴性蛋白激酶途徑是研究最早的學(xué)習(xí)記憶相關(guān)通路，活化的PKA可直接激活下游CREB而調(diào)控學(xué)習(xí)記憶功能。ERK信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有調(diào)控細(xì)

12、胞增殖分化和學(xué)習(xí)記憶等多種功能，與腦內(nèi)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的形成以及空間學(xué)習(xí)記憶功能有重要的聯(lián)系。本研究中，檢測(cè)CREB上游的主要調(diào)控激酶發(fā)現(xiàn)ERK的磷酸化蛋白表達(dá)也顯著降低，而PKA、p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)則沒有明顯改變。由于ERK和CREB均在空間記憶和長(zhǎng)時(shí)程記憶中起重要作用，表明ERK-CREB信號(hào)途徑可能是CPF重復(fù)染毒致長(zhǎng)時(shí)程空間記憶障礙的重要調(diào)控通路。
　　 綜上所述，CPF低劑量重復(fù)染毒能夠抑制ERK-CREB信號(hào)