葉酸對(duì)糖尿病認(rèn)知功能障礙作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　1.通過(guò)檢測(cè)輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)與正常認(rèn)知功能的老年2型糖尿病(type2diabetes mellitus，T2DM)患者外周血葉酸、甲基代謝產(chǎn)物及炎癥因子，分析并探討老年T2DM患者外周血葉酸、甲基代謝產(chǎn)物及炎癥因子與MCI之間的相關(guān)性。
　　2.通過(guò)觀察不同葉酸水平對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的DM小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷情況，探

2、討不同葉酸水平對(duì)DM小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的改善作用及其可能機(jī)制，為DM合并認(rèn)知功能的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.對(duì)住院的T2DM患者進(jìn)行簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表和記憶問(wèn)卷，篩選MCI(T2DM-MCI)患者50名，按年齡±3歲、性別相同、文化程度一致相配比，隨機(jī)選取50名認(rèn)知功能正常(T2DM with normal cognition，T2DM-NC)作為對(duì)照組進(jìn)行病例對(duì)照研究;采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定病例組與對(duì)照組的血清葉酸濃

3、度，高效液相色譜法測(cè)定病例組與對(duì)照組的血漿S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)濃度，ELISA法檢測(cè)病例組與對(duì)照組的血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白介素(interleukin，IL)-6濃度，免疫比濁法測(cè)定病例組與對(duì)照組的超敏C反應(yīng)

4、蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hS-CRP)濃度。應(yīng)用條件Logistic回歸分析法分析葉酸、甲基供體及炎癥因子與MCI的關(guān)系。
　　2.STZ腹腔注射誘導(dǎo)的DM小鼠隨機(jī)分為4組:DM葉酸缺乏組(DM fed with folic acid deficient diet,DM-FD，n=15)、DM模型組(DM，n=15)、DM葉酸補(bǔ)充組(DM with folic acid sup

5、plement，DM-FS，n=15)和胰島素治療組(DM with insulin treatment，DM-Ins，n=13)，另選同月齡同窩別C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組(normal controls，NC，n=10)。DM-FS組每日予葉酸溶液(120μg/kg·d)灌胃，其他各組以同體積雙蒸水灌胃;DM-Ins組給予皮下注射甘精胰島素(2～6U/kg·d)降糖治療，使隨機(jī)血糖控制在10～16mmol/L;干預(yù)8w。采用

6、Moms水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)各組學(xué)習(xí)記憶能力;采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各組血清葉酸濃度;采用高效液相色譜法檢測(cè)各組血漿Hcy濃度和腦組織SAM、SAH含量;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)各組淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursor protein，APP)、早老素(presenilin，PS)1、PS2、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)、TNF-α和IL-6mRNA表達(dá);采用West

7、ern Blotting(WB)法檢測(cè)各組APP、PS1、PS2、Tau及磷酸化Tau Ser396(phosphorylated Tau Ser396，pTau Ser396)、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase，PP2A)及其去甲基(demethylated PP2A，demPP2A)和甲基化PP2A(methylated PP2A，metPP2A)、糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase

8、，GSK)-3β及磷酸化GSK-3βSer9(pGSK-3βSer9)的蛋白表達(dá);采用免疫組化檢測(cè)各組海馬pTau Ser396表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.DM合并MCI患者人群病例對(duì)照研究
　　T2DM-MCI組患者血清葉酸、血漿SAM水平和SAM/SAH比值明顯低于T2DM-NC組(P＜0.05);T2DM-MCI組患者IL-6、hs-CRP濃度則明顯高于T2DM-NC組(P＜0.05)。條件logistic回歸分

9、析顯示經(jīng)DM病程、GHbA1c、DM視網(wǎng)膜病變和心血管危險(xiǎn)因素調(diào)整后，較高水平的外周血葉酸、SAM和SAM/SAH是T2DM患者M(jìn)CI的保護(hù)性因素(OR值分別為0.72、0.96、0.68，P＜0.05);上三分位水平組的IL-6、hs-CRP與MCI高風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)(OR值分別為10.29、5.12,P＜0.05)
　　2.葉酸對(duì)DM小鼠認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制的探討
　　(1)Morris水迷宮試驗(yàn):定向航行試驗(yàn)中DM組逃避

10、潛伏期明顯大于NC組(P＜0.05);與DM組相比，DM-FD組明顯延長(zhǎng)，胰島素治療后則明顯縮短(P＜0.05);空間探索實(shí)驗(yàn)中，DM組穿越目標(biāo)區(qū)次數(shù)明顯少于NC組(P＜0.05），DM-FD組進(jìn)一步減少，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DM-FS組明顯大于DM-FD組(P＜0.05）。
　　(2)葉酸、甲基代謝產(chǎn)物及DNMTs:血清葉酸濃度以DM-FS組最高，DM-FD組最低，其他三組介于兩者之間(P＜0.05);NC、DM

11、和DM-Ins三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。STZ注射后血漿Hcy濃度明顯下降，腦組織SAM濃度、SAM/SAH比值明顯升高，DM-FD組則使血漿Hcy、腦組織SAH濃度升高，降低腦組織SAM濃度及SAM/SAH比值(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果，DM組小鼠腦組織三種DNMTs(DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)mRNA表達(dá)量低于NC組，DM-FD組DNMTs mRNA表達(dá)量進(jìn)一步減少(P＜0.05），補(bǔ)充葉酸或胰島

12、素治療后其表達(dá)量有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　(3)Tau、GSK-3β和PP2A:五組間腦組織Tau蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。免疫組化顯示，DM組海馬CA3區(qū)pTau Ser396表達(dá)量明顯多于NC組，DM-FD組進(jìn)一步增多(P＜0.05）。WB顯示DM組pGSK-3βSer9顯著低于NC組(P＜0.05)，胰島素治療能顯著增加其表達(dá)量（P＜0.05），不同水平葉酸對(duì)其則無(wú)明顯影響;DM組met

13、PP2A表達(dá)量顯著低于NC組(P＜0.05)，DM-FD組表達(dá)量進(jìn)一步明顯降低(P＜0.05）。
　　(4)APP、PS1、PS2:五組間腦組織APP、PS1、PS2mRNA和蛋白表達(dá)差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(5)IL-6和TNF-α:DM組的腦組織IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)量均明顯高于NC組(P＜0.05);DM-FD組進(jìn)一步明顯升高(P＜0.05），經(jīng)補(bǔ)充葉酸或胰島素治療后，其表達(dá)量有所回降，但差

14、別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.老年T2DM患者葉酸缺乏、甲基代謝紊亂、全身慢性低度炎癥狀態(tài)可能與MCI相關(guān)，提示適當(dāng)補(bǔ)充葉酸和降低炎癥反應(yīng)可能有助于防治DM患者認(rèn)知功能障礙。
　　2.STZ誘導(dǎo)DM小鼠學(xué)習(xí)、空間記憶能力明顯受損，葉酸缺乏可進(jìn)一步加重?fù)p傷，胰島素治療可改善認(rèn)知功能障礙。綜合以上結(jié)果，其可能機(jī)制:胰島素缺乏一方面可能下調(diào)pGSK-3βser9的表達(dá)以增加GSK-3β活性，另一方面可