Grb10在糖尿病腦病大鼠認(rèn)知功能障礙中的作用機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病糖代謝紊亂可損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。其主要表現(xiàn)為近事記憶力和學(xué)習(xí)能力下降，同時伴有腦皮質(zhì)以及相關(guān)核團(tuán)結(jié)構(gòu)改變、神經(jīng)生理障礙以及神經(jīng)精神相關(guān)方面的病理變化，統(tǒng)稱為“糖尿病腦病”。糖尿病腦病作為糖尿病的腦內(nèi)并發(fā)癥，有“3型糖尿病”之稱，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，因而也缺乏有效的防治手段，因此其發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)受到了學(xué)術(shù)界的廣泛重視。近年來研究證實，IGF-1R、IR信號通路在糖尿病認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

2、　　 Grb10(Growth factor receptor-bound protein10)蛋白作為Src同源區(qū)2(SH2)結(jié)構(gòu)域包含蛋白，是多重跨膜酪氨酸受體綁定蛋白的成分之一。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1R(insulin-like growth factor receptor)以及IR(insulin receptor)是其綁定的主要受體。在大腦中，Grb10的主要表達(dá)區(qū)域在海馬組織，該區(qū)域主要參與了認(rèn)知功能調(diào)節(jié)。但是，內(nèi)源性Grb1

3、0在IGF1-IR信號通路中的作用機(jī)制卻不甚明確。
　　 目的:
　　 觀察糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的Grb10基因、蛋白表達(dá)水平、以及糖尿病腦病大鼠的行為學(xué)改變和海馬病理變化;在下調(diào)Grb10表達(dá)的狀態(tài)下觀察糖尿病腦病大鼠認(rèn)知功能障礙的改善以及海馬神經(jīng)元的相關(guān)病理變化。由此在體內(nèi)實驗中證實內(nèi)源性Grb10在糖尿病腦病中的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 單次STZ溶液腹腔注射(0.1M， PH4.5，70mg

4、/Kg)建立糖尿病模型。之后一周監(jiān)測血糖（鼠尾靜脈血），將血糖達(dá)到18mmol/L的大鼠作為糖尿病組，血糖值未達(dá)標(biāo)的剔除。同時設(shè)立相同數(shù)量的正常對照組，將糖尿病(DM)組和對照(con)組分別隨機(jī)分為三組，設(shè)為假手術(shù)組（DM+0組，con+0組）非手術(shù)組（DM組，con組）以及干預(yù)組（DM+shRNA組，con+shRNA組），每組10只。利用慢病毒載體攜帶Grb10-shRNA（short hairpin RNA）通過立體定位注射技術(shù)

5、，將Grb10-shRNA定向?qū)氪笫蠛ｑR神經(jīng)元，可以成功在活體內(nèi)高效、穩(wěn)定、組織特異的下調(diào)Grb10蛋白的表達(dá)。3個月之后，進(jìn)行大鼠認(rèn)知功能（Morris水迷宮測試）、Grb10蛋白表達(dá)水平(q PCR、Western Blot檢測)測定以及相應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)和病理結(jié)構(gòu)觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組Grb10表達(dá)的測定
　　 Grb10的mRNA以及蛋白表達(dá)水平分別由qPCR以及Western Blot測定以

6、評估該方法在體內(nèi)實驗中的基因敲低效果。結(jié)果顯示在DM+Grb10-shRNA組對比DM以及DM+0組，Grb10的mRNA以及蛋白水平均有顯著下降(P＜0.05or0.01)而con+shRNA組與對照組對比并未見明顯表達(dá)差異。
　　 2.Grb10-shRNA對糖尿病大鼠認(rèn)知功能的影響
　　 立體定位手術(shù)以及手術(shù)創(chuàng)傷并未對大鼠認(rèn)知功能造成影響，水迷宮結(jié)果(P＞0.1)。在糖尿病模型建立時，即血糖上升至糖尿病標(biāo)準(zhǔn)時，各組

7、水迷宮實驗結(jié)果（潛伏期）并未見明顯差異(P=0.13)。
　　 3個月之后，同對照組以及DM+shRNA組比較，糖尿病組的在訓(xùn)練后潛伏期明顯延長，差異有顯著性(P＜0.01)，同時也證明糖尿病腦病造模成功。DM+shRNA組和對照組之間并未見顯著差異，con+shRNA與con之間也未見顯著差異，說明DM組潛伏期延長是由糖尿病高糖造成而并非shRNA或者立體定位注射手術(shù)所造成。
　　 在正式實驗階段，站臺所在位置穿越次數(shù)

8、以及目的象限徘徊時間兩項數(shù)據(jù)，DM組與對照組也存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05 or0.01)。DM組以及DM+0組相比其余組有明顯減少，兩者之間并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。同時，DM+shRNA組與對照組之間并無統(tǒng)計學(xué)差異，shRNA對正常大鼠無影響。
　　 3.海馬免疫組織化學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)
　　 持續(xù)高糖狀態(tài)導(dǎo)致了一系列的病理生理變化。
　　 病理HE染色顯示，DM組以及DM+0組海馬組織神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元排列紊

9、亂，細(xì)胞膜皺縮或者胞體腫脹，胞質(zhì)深染，細(xì)胞核大且結(jié)構(gòu)不清，膠質(zhì)細(xì)胞增生極度活躍。DM+shRNA組上述病理改變明顯減輕，僅膠質(zhì)增生較活躍。shRNA對對照組并無明顯影響。
　　 免疫組化可見海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、Grb10表達(dá)的位置以及通過IPP軟件可對Grb10蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。可見Grb10表達(dá)聚集于細(xì)胞膜，并且DM與DM+shRNA之間有肉眼可見的表達(dá)差異(P＜0.01)。在相應(yīng)的HE染色切片上可見，Grb10過表達(dá)

10、的DM組神經(jīng)元形態(tài)病理變化明顯。
　　 電鏡結(jié)果與病理以及免疫組化結(jié)果一致，并且可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸在DM組明顯減少，有突觸功能障礙，但此改變在DM+shRNA組明顯減輕，由此可見Grb10表達(dá)下調(diào)在糖尿病腦病中可明顯改善突觸功能由此緩解認(rèn)知功能障礙。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過腹腔注射STZ建立糖尿病模型的方式，可成功建立糖尿病腦病模型，獲得大鼠行為學(xué)改變的數(shù)據(jù)特點和認(rèn)知功能障礙相應(yīng)的病理學(xué)改變證據(jù)。<

11、br>　　 2.shRNA慢病毒顆?？煞€(wěn)定下調(diào)腦內(nèi)海馬區(qū)的Grb10蛋白表達(dá)水平，并且可見糖尿病大鼠的認(rèn)知功能水平與海馬的Grb10表達(dá)水平密切相關(guān)，并可從病理改變和超微結(jié)構(gòu)水平找到相應(yīng)的支持證據(jù)。
　　 3.結(jié)合國際上在體外實驗階段的研究結(jié)果可見，Grb10的負(fù)性調(diào)節(jié)主要是通過對IGF1-IR信號通路得以實現(xiàn)。即，Grb10的過表達(dá)作為該信號通路重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因素，可推測，Grb10的過表達(dá)是糖尿病認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制的重要