miR-92a在糖尿病勃起功能障礙大鼠中的作用及機制初探.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 糖尿病ED大鼠模型的建立
　　目的:建立PDE5i治療效果不佳的糖尿病ED大鼠模型
　　方法:采用腹腔注射鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠，10周后，對存活的糖尿病大鼠進行阿撲嗎啡（APO）篩選實驗。以大鼠陰莖體增長、露出作為勃起功能良好的標志，即APO(+)；反之，為APO(-)。隨后，對APO(-)和APO(+)糖尿病大鼠進行海綿體壓力測定以及PDE5i治療效果的評價。最后，

2、對APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中NO/cGMP通路、RhoA/Rho激酶通路及細胞凋亡進行檢測。
　　結果:與正常對照大鼠相比，APO(-)糖尿大鼠和 APO(+)糖尿病大鼠勃起功能均明顯降低，但APO(-)糖尿大鼠勃起功能更差。當給予APO(+)糖尿病大鼠PDE5i（艾力達2.08mg/kg，海綿體測壓半小時前灌胃給予，相當60 kg成人20mg的等效劑量）治療后，其勃起功能明顯改善，基本上可以達到正常水平，而APO(-)糖尿

3、病大鼠對PDE5i治療的反應性差，盡管海綿體內壓有所提高，但仍遠低于正常水平。機制研究發(fā)現(xiàn)APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中 P-eNOS/eNOS明顯下降， ROCK2表達水平和P-MYPT1/MYPT1明顯上升，且凋亡細胞顯著增多。
　　結論:阿撲嗎啡實驗可成功篩選出對PDE5i治療效果不佳的糖尿病ED大鼠。
　　第二部分 糖尿病ED大鼠陰莖組織內miRNAs表達譜分析及驗證
　　目的:篩選出可能與糖尿病大鼠勃起功能

4、相關的重要miRNAs
　　方法:提取糖尿病ED大鼠（APO(-)糖尿病大鼠）陰莖組織RNA，采用Agilent Rat miRNA V18.0芯片，對已知的677個miRNAs進行檢測。采用Real-time PCR，對差異顯著的miRNAs進行驗證，同時檢測其下游靶基因的mRNA表達水平。
　　結果:在APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中，3個miRNAs變化明顯（下調1/3以上或上調至少3倍，P＜0.05 vs正常對照組，

5、且探針平均信號值大于4）。其中，miR-133b表達明顯下調，miR-92a和miR-29b表達明顯上調。采用Real-time PCR方法，發(fā)現(xiàn)miR-133b表達下降，miR-92a和miR-29b表達上升，與miRNA芯片結果一致，同時發(fā)現(xiàn)miR-92a在陰莖海綿體、主動脈、大腦、腎臟、心臟和肝臟中均有表達。與其他組織和器官相比，miR-92a在陰莖組織中表達豐度相對較低。進一步對miR-92a的下游靶基因進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)eN

6、OS和DKK3的mRNA表達水平在APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中明顯下降，而CD49e、klf2和klf4的mRNA表達水平無明顯變化。
　　結論:miR-92a在糖尿病ED大鼠陰莖組織中高表達可能與eNOS和DKK3的表達水平下調相關。
　　第三部分 高糖環(huán)境下主動脈內皮細胞中miR-92a及其靶基因的表達變化研究
　　目的:在體外水平研究高糖對內皮細胞中miR-92a及其靶基因的表達變化
　　方法:采用貼壁

7、法培養(yǎng)原代大鼠主動脈內皮細胞，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)后，提取主動脈內皮細胞RNA，對miR-92a、eNOS和DKK3的表達水平進行檢測。同時，提取內皮細胞蛋白，對eNOS和DKK3的蛋白表達水平進行檢測。在高糖培養(yǎng)下，給予miR-92a拮抗劑antagomir-miR-92a后，提取主動脈內皮細胞RNA和蛋白，檢測eNOS和DKK3的表達水平。
　　結果:在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時和72小時后，miR-92a的表達水平在主動脈內皮細胞中

8、均明顯上調，且呈遞增趨勢；eNOS和DKK3的mRNA表達水平均明顯下調，且呈遞減趨勢。同時，eNOS和DKK3的蛋白表達水平在高糖刺激72小時的主動脈內皮細胞中明顯降低。當使用 antagomir-miR-92a預處理主動脈內皮細胞后，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)72小時后，與對照組（antagomir-miR-NC）相比，主動脈內皮細胞中eNOS和DKK3蛋白表達水平明顯升高。
　　結論:主動脈內皮細胞中miR-92a在高糖環(huán)境下表達上調

9、，進而抑制eNOS和DKK3表達。
　　第四部分 miR-92a-inhibition對糖尿病ED大鼠勃起功能的作用及機制初探
　　目的:】拮抗miR-92a是否可以改善糖尿病ED大鼠勃起功能及初步機制的探索
　　方法:以慢病毒為載體，構建表達與 miR-92a序列互補的miR-92a-inhibition（Lv-miR-92a-inhibition）。用貼壁法培養(yǎng)原代大鼠主動脈內皮細胞，主動脈細胞轉染Lv-miR-9

10、2a-inhibition后，檢測eNOS和DKK3的表達水平。鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠后，采用阿撲嗎啡實驗篩選出 APO(-)糖尿病大鼠。向 APO(-)糖尿病大鼠陰莖海綿體內局部注射 Lv-miR-92a-inhibition，治療2周后，采用電刺激海綿體神經測定大鼠陰莖海綿體內壓，評價勃起功能。留取大鼠陰莖組織后，對eNOS和DKK3的蛋白表達水平進行檢測。
　　結果:成功構建了慢病毒介導的miR-92a-inhibitio

11、n，當其轉染主動脈內皮細胞96小時后，主動脈內皮細胞中eNOS和DKK3的mRNA和蛋白表達水平明顯上調。向APO(-)糖尿病大鼠注射Lv-miR-92a-inhibition2周后，其勃起功能明顯改善。初步的機制研究發(fā)現(xiàn)Lv-miR-NC-inhibition治療后，APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中eNOS蛋白表達水平明顯上調，接近于正常水平，同時DKK3蛋白表達水平也明顯上調，但低于正常水平。
　　結論:miR-92a-inh