高脂致糖尿病大鼠β細胞功能障礙的機制及胰島素治療作用的研究.pdf

1、目的：觀察高脂對糖尿病(DM)大鼠β細胞功能的影響及其機制，并探討胰島素治療的作用。 方法：采用小劑量鏈脲佐菌素(STZ，25mg/kg體重)和高脂飲食誘導的方法建立DM大鼠模型。DM大鼠隨機分為3組：DM高脂飲食(DH)組、DM正常飲食(DN)組和DM高脂飲食及胰島素治療(DHI)組；正常Wistar大鼠為正常對照(NC)組。DH組及DHI組大鼠給予高脂喂養(yǎng)，DN組和NC組大鼠給予正常飲食，同時DHI組大鼠給予胰島素治療。10

2、周后，行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)，測定血糖和血胰島素值，并根據血糖和血胰島素值計算糖負荷后胰島素增值與血糖增值的比值(△I30/△G30)和修正的β細胞胰島素分泌指數(MBCI)。取胰腺：胰頭部分做石蠟切片，胰尾部分液氮保存。SABC方法定位β細胞內的胰島素，半定量分析胰島素蛋白的表達，并測定相對β細胞數量和平均β細胞面積。RT-PCR技術半定量分析胰島素、絲氨酸軟脂酰轉移酶(SPT)及Caspase-3基因表達。酸乙醇方法抽提胰

3、腺內胰島素并測定。免疫熒光雙標記和免疫印跡法測定β細胞內的增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達。免疫熒光雙標記法測定Bcl-2蛋白表達。碘化丙啶(PI)法測定β細胞的凋亡。同時測定血和胰腺內的FFA和TG。 結果：與NC組相比，DH組和DN組的血和胰腺內的FFA和TG增加，胰島素蛋白及基因表達和胰島素含量下降；葡萄糖刺激的胰島素分泌曲線低平；△I30/△G30和MBCI下降，其中以DH組更明顯(P＜0.05)。 與NC組相

4、比，DN組和DH組的相對β細胞數量和平均β細胞面積減少；β細胞的凋亡、SPT和Caspase-3基因表達水平均升高，而Bcl-2和PCNA的蛋白表達降低，且以DH組的改變最顯著(P＜0.05～P＜0.01)。 與DH組相比，DHI組大鼠經過胰島素治療后，血FFA和TG水平雖然沒有明顯改善，但是胰腺內的TG、FFA明顯降低。同時胰島素基因及蛋白表達和胰島素含量增加；胰島素分泌功能、△I30/△G30和MBCI改善；相對β細胞數量和

5、平均β細胞面積增加；β細胞凋亡、SPT和Caspase-3基因的表達水平均降低；Bcl-2和PCNA的表達改善(P＜0.05～P＜0.01)。 結論：長期高脂可促使小劑量STZ和高脂飲食誘導的DM大鼠胰島素分泌功能障礙，且β細胞分泌功能障礙與胰島素基因和蛋白表達下降致β細胞內的胰島素含量降低及β細胞增殖降低，凋亡增加致β細胞數量減少有關。胰島素治療對高脂所致的上述作用有保護作用，這種保護作用部分和胰腺內FFA及TG沉積改善相關。

6、 第一部分DM大鼠模型的建立及其代謝特點的研究 目的：觀察小劑量STZ和高脂飲食誘導的DM大鼠的血糖、血脂(FFA和TG)、血胰島素、胰島素敏感性指數(ISI)和胰島素抵抗指數的特點。 方法：雄性Wistar大鼠隨機分為NC組和模型組。模型組大鼠給予STZ(25mg/kg體重)腹腔注射，NC組大鼠給予相應劑量的檸檬酸緩沖液。2w后行OGTT，糖耐量異常者給予高脂飲食。NC組大鼠仍給予正常飲食。模型組大鼠飼以高脂飲

7、食8w后行OGTT，測定血糖，確定DM大鼠模型有無建立。測定DM大鼠血游離脂肪酸(FFA)、血甘油三酯(TG)、血膽固醇(Chol)及血胰島素，并根據血糖和血胰島素值計算ISI和胰島素抵抗指數。 結果：DM組大鼠0min、30min、60min和120min的血糖分別為NC組大鼠對應時點血糖的1.5倍、1.4倍、1.5倍和1.6倍，且差異均具有顯著性(P＜0.01)；同時血FFA、TG和Chol也明顯增加，分別為NC組的1.9倍

8、(P＜0.01)、1.4倍(P＜0.01)和1.6倍(P＜0.01)。DM組大鼠空腹胰島素為NC組大鼠的1.2倍(P＜0.05)，并且ISI下降，胰島素抵抗指數增加，與NC組相比，差異具有顯著性(P＜0.01、P＜0.01)。 結論：用小劑量STZ和高脂飲食誘導的DM大鼠具備高血糖、脂代謝紊亂、胰島素抵抗(IR)和高胰島素血癥的特點。 第二部分高脂對DM大鼠胰島素基因和蛋白表達、胰島素含量及胰島素分泌功能的影響

9、目的：觀察高脂對DM大鼠β細胞胰島素基因和蛋白表達、胰島素含量和胰島素分泌功能的影響。 方法：DM大鼠隨機分為2組：DH組和DN組；正常Wistar大鼠為NC組。DH組大鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，DN組大鼠正常飼料喂養(yǎng)。10周后，三組大鼠行OGTT，測定0min、30min、60min和120min的血糖和胰島素值。并根據血糖和血胰島素值計算△I30/△G30和MBCI。取胰腺：胰頭部分做石蠟切片，胰尾部分液氮保存。SABC方法定位β細胞

10、內的胰島素，并半定量分析胰島素蛋白的表達。RT-PCR技術半定量分析胰島素基因表達，酸乙醇方法抽提胰腺內胰島素并測定。同時測定血和胰腺內的FFA和TG。 結果：與NC組相比，DH組和DN組的血和胰腺內的FFA和TG增加，葡萄糖刺激的胰島素分泌曲線低平，△I30/△G30和MBCI顯著下降，以DH組為著，差異均具有顯著性(P＜0.05～P＜0.01)。DN組和DH組胰島素蛋白和基因表達及胰島素含量均明顯低于NC組，其中以DH組降低

11、更明顯(P＜0.05)。 結論：長期高脂可損傷DM大鼠胰島素基因和蛋白的表達，同時細胞內的胰島素含量降低，β細胞胰島素分泌功能顯著下降。且高脂導致的上述改變可能和胰腺內的脂質沉積有關。 第三部分高脂對DM大鼠β細胞數量的影響及β細胞凋亡可能的影響因素 目的：觀察高脂對DM大鼠β細胞增殖、β細胞凋亡及β細胞數量的影響及凋亡的相關因素。 方法：SABC法定位NC組、DN組和DH組大鼠β細胞內的胰島素后，測定平

12、均β細胞面積和相對B細胞數量；免疫熒光雙標記和免疫印跡法測定β細胞內的PCNA蛋白表達；免疫熒光雙標記法測定Bcl-2蛋白表達；PI法測定β細胞的凋亡；并應用RT-PCR技術檢測凋亡相關蛋白絲氨酸軟脂酰轉移酶(SPT)和Caspase-3的基因表達。 結果：DN組和DH組的相對β細胞數量和平均β細胞面積均較NC組減少(P＜0.05～P＜0.01)，且以DH組的改變顯著(P＜0.05)。DN組的β細胞的凋亡率、SPT和Caspas

13、e-3基因表達水平較NC組升高，而Bcl-2和PCNA的蛋白表達較NC組下降(P＜0.05)。DH組的β細胞凋亡、SPT和Caspase-3基因表達的升高和Bcl-2及PCNA蛋白表達的下降則進一步加劇(vsDN組，P＜0.05～P＜0.01)。 結論：高脂可導致DM大鼠β細胞數量減少，這種數量減少是由于β細胞凋亡增加，增殖能力降低所致。β細胞凋亡可能系SPT和Caspase-3表達增加，Bcl-2表達下降所致。 第四部

14、分胰島素治療對高脂導致的DM大鼠β細胞功能障礙的作用及機制 目的：胰島素治療對高脂導致的DM大鼠β細胞功能障礙的作用及可能的機制。方法：DM大鼠隨機分為3組：DH組、DN組和DHI組，及NC組。DH組和DHI組大鼠高脂喂養(yǎng)，DN組和NC組大鼠給予正常飲食，DHI組大鼠同時給予胰島素治療。胰島素治療10周后，行OGTT及取胰腺組織，測定指標同第二、第三部分。 結果：與DH組相比，DHI組大鼠經過胰島素治療后，血FFA和TG

15、水平雖然沒有明顯改善，但是胰腺內的TG、FFA明顯降低。胰島素基因及蛋白表達和胰島素含量增加，分別為DH組的4.41倍(P＜0.01)、2.11(P＜0.01)倍和1.47倍(P＜0.05)；胰島素分泌功能較DH組有所恢復，△I30/△G30和MBCI高于DH組(P＜0.05～P＜0.01)。同時相對β細胞數量和平均β細胞面積較DH組得以改善(P＜0.01、P＜0.05)；β細胞凋亡、SPT和Caspase-3基因的表達、Bcl-2和P