IPS細(xì)胞聯(lián)合VEGF基因治療糖尿病性勃起功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　由于飲食結(jié)構(gòu)的變化,人們生活水平的不斷提高,肉類等高脂,高蛋白進(jìn)食過多，體力活動(dòng)減少導(dǎo)致的肥胖是2型糖尿病最主要的環(huán)境因素，所以近些年以糖尿病(Diabetes mellitus,DM)為代表的代謝性疾病患病率有逐年上升的趨勢，其中以男性糖尿病患者并發(fā)勃起功能障礙（Erectile dysfunction,ED)的發(fā)病率就顯著高于普通人群。陰莖血管內(nèi)皮損傷是勃起功能障礙的主要機(jī)制[1]，男性糖尿病患者由于陰莖血管內(nèi)

2、皮比正常人更容易受損而導(dǎo)致糖尿病性勃起功能障礙(diabeticerectile dysfunction，DED)有較高的發(fā)病率[2]。DED目前還沒有很好的治療方法，比較常用的藥物有5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑如他達(dá)拉非等,目前統(tǒng)計(jì)來看有效率僅為一半左右[3]。還有一些其它療法,如陰莖海綿體內(nèi)或尿道內(nèi)注射PGEI（前列腺激素的）等藥物，但是因?yàn)榀熜Р荒艹志?，需要反?fù)、頻繁局部注射，并發(fā)癥較多，所以難以推廣應(yīng)用；也有使用手術(shù)治療方法

3、如陰莖假體植入術(shù)等治療該病,但由于假體價(jià)格過高，且存在感染風(fēng)險(xiǎn)等，并發(fā)癥較多[4]。因此，目前還沒有一種公認(rèn)的有效的方法來治療糖尿病性勃起功能障礙(diabeticerectile dysfunction，DED),所以尋找DED的治療方法是今年男科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，基因治療是一種潛在的治療方法。本課題中我們從糖尿病性勃起功能障礙發(fā)病的病因入手設(shè)計(jì)治療方法。探討基因修復(fù)陰莖血管內(nèi)皮功能的可能性。有部分研究針對基因來治療DED作了許多嘗

4、試并取得了一些效果，如Dall等[3]證實(shí)VEGF基因能改善DED大鼠的勃起功能；但是基因治療最大的局限
　　在于其載體,如何讓目的基因在需要治療的地方進(jìn)行表達(dá)是關(guān)鍵，目前采用的方法有采用病毒載體把目的基因帶入體內(nèi)進(jìn)行表達(dá),但是病毒載體有諸多危險(xiǎn)性如:局部炎癥反應(yīng),感染的風(fēng)險(xiǎn),目的基因在體內(nèi)隨機(jī)表達(dá)等副作用限制了它的在臨床的應(yīng)用,其他載體如質(zhì)粒,但其轉(zhuǎn)染率則非常低，不適合臨床應(yīng)用。近年來干細(xì)胞的研究取得了很大的進(jìn)展，我們前期研究發(fā)

5、現(xiàn)用干細(xì)胞治療能夠解決以上我們面臨的諸多問題，因?yàn)楦杉?xì)胞具有多能性而且轉(zhuǎn)染目的基因后其多向分化能力仍不受影響、體外容易擴(kuò)增、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率高、表達(dá)目的基因持久等優(yōu)點(diǎn)成為目前基因治療載體的最佳選擇。干細(xì)胞可以作為載體進(jìn)行基因治療,而且干細(xì)胞還可能作為種子細(xì)胞替換功能受損的組織細(xì)胞，繼續(xù)表達(dá)目的基因,并且持續(xù)時(shí)間長久。目前干細(xì)胞己應(yīng)用于許多疾病的治療如各種血液腫瘤疾病等，但是在治療糖尿病性勃起功能障礙方面還是比較不多見的，目前只有Bivalac

6、qua等[4]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）應(yīng)用于治療老年性ED取得了一定療效，他們發(fā)現(xiàn)將eNOS基因（內(nèi)皮型一氧化氮合酶）轉(zhuǎn)入BMSC后可提高療效。但是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在取材不便、培養(yǎng)誘導(dǎo)效率低下，不宜大規(guī)模應(yīng)該于臨床等問題，限制了它的應(yīng)用。IPS細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPS，簡稱誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)，技術(shù)可以克服以上的難題。本課題我們探討應(yīng)用IPS細(xì)胞作為基因治療載體治療DED的可行性

7、，設(shè)計(jì)使用比BMSCs更具有優(yōu)勢的IPS細(xì)胞作為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的載體來治療DED的研究，希望能夠解決一直困擾著人們的DED治療難題。
　　針對這一問題，我們己經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)的前期研究：我們成功地進(jìn)行了IPS細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和體外誘導(dǎo)分化研究[5，6,7，8]，發(fā)現(xiàn)IPS細(xì)胞與BMSCs有相似的生物學(xué)特性，同時(shí)具有來源充足、取材安全簡便、分離培養(yǎng)容易、體外增殖能力強(qiáng)、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率高等優(yōu)點(diǎn)，使其更適合于臨床應(yīng)用；至

8、今為止，小鼠、人、獼猴、大鼠、豬等物種都已建立了iPS細(xì)胞系[7,12-15]。而且通過四倍體囊胚嵌合技術(shù)，證實(shí)了小鼠iPS細(xì)胞能發(fā)育成為完整的小鼠個(gè)體[16]。目前，iPS技術(shù)已迅速向醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用方面展開，特別是在病理模型方面進(jìn)展顯著，已建立了十多種人類疾病模型的iPS細(xì)胞株[17-18]，所以我們探討采用IPS作為種子細(xì)胞針對DED的核心發(fā)病機(jī)制-血管內(nèi)皮功能障礙環(huán)節(jié)進(jìn)行治療。目前我們還完成了慢病毒-VEGF的構(gòu)建的前期工作。將進(jìn)一

9、步摸索和確定IPS的感染條件和感染參數(shù)。
　　研究目的：
　　1）建立和完善IPS作為種子細(xì)胞的方法。
　　2）建立將VEGF基因高效轉(zhuǎn)染的載體和IPS的培養(yǎng)建系。
　　3）構(gòu)建慢病毒-VEGF基因載體，并轉(zhuǎn)染IPS；將轉(zhuǎn)染VEGF基因后的IPS細(xì)胞進(jìn)行Elisa，Western blot，RT-qPCR等檢測，以證明能有效分泌VEGF。
　　4）探索IPS聯(lián)合VEGF基因治療DED的可行性及作用機(jī)制

10、>　　研究方法：
　　1）SD大鼠iPS細(xì)胞的制備。
　　2）iPS細(xì)胞的培養(yǎng)建系。
　　3）慢病毒-VEGF載體的構(gòu)建。
　　4）慢病毒-VEGF轉(zhuǎn)染IPS。
　　研究結(jié)果：
　　1）成功誘導(dǎo)IPS細(xì)胞。
　　2）成功構(gòu)建慢病毒-VEGF基因載體，成功感染IPS并建系。
　　3）通過轉(zhuǎn)染IPS的種子細(xì)胞能有效分泌VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)修復(fù)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　結(jié)論：