糖尿病膀胱病排尿功能障礙的機制研究.pdf

1、糖尿病膀胱?。╠iabetic cystopathy,DCP）在糖尿病人群中發(fā)生率在25％-85％之間，是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥之一。臨床表現(xiàn)為膀胱過度活動、排尿困難等癥狀，輸尿管返流、腎積水，產(chǎn)生腎功損害能和尿路感染。尿路感染是糖尿病患者常見死亡原因?？梢娞悄虿“螂子绊懖∪苏Ｉ鐣顒?，危害病人生理及心理健康，嚴重影響病人的生活質(zhì)量，甚至威脅生命。DCP的發(fā)病機制較為復(fù)雜，包括膀胱功能障礙和尿道功能障礙兩個方面，具體表現(xiàn)為膀胱逼

2、尿肌損傷、尿道括約肌改變、神經(jīng)功能障礙以及氧化應(yīng)激損傷等方面。
　　DCP的發(fā)生與血管、周圍神經(jīng)病變關(guān)系密切。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)研究發(fā)現(xiàn)主要在交感神經(jīng)中表達，對維持周圍神經(jīng)正常功能有重要作用。既往國內(nèi)外研究均提示NGF可能在糖尿病膀胱病排尿障礙病變中起重要作用。ProNGF是NGF的前體，NGF/ProNGF通路在尿道功能障礙中是否發(fā)揮作用，仍然值得進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠尿道收縮

3、壓基線升高，使用α1腎上腺素受體拮抗劑可以降低尿道收縮壓基線。糖尿病尿道中分子水平α1受體表達情況尚不清楚。
　　DCP的發(fā)生除尿道功能障礙的影響外，膀胱功能障礙也至關(guān)重要。近期研究提示糖尿病膀胱功能障礙在很大程度上是由于膀胱逼尿肌神經(jīng)、受體發(fā)生改變。大麻素受體（cannabinoid receptors，CB receptors）是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的重要組成部分，CB受體可以影響多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括抑制腺苷酸環(huán)化酶、抑制

4、鈣通道、激活鉀通道、激活MAP激酶通道等。在心血管系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、疼痛信號傳導(dǎo)、能量代謝以及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等多個方面發(fā)揮重要作用。越來越多的證據(jù)表明大麻素受體可能在膀胱中存在并且在膀胱功能障礙中發(fā)揮重要作用，但在糖尿病膀胱分子水平變化尚不清楚。
　　葡萄多酚（Grape Seed Proanthocyanidin Extracts，GSPE）是從葡萄子中提取的一種天然多酚類化合物。目前關(guān)于葡萄多酚的研究領(lǐng)域非常廣泛，已涉及心腦血管系

5、統(tǒng)、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、類風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)等領(lǐng)域。研究證實葡萄多酚對于糖尿病外周神經(jīng)病變起重要保護作用，葡萄多酚干預(yù)后，糖尿病大鼠運動神經(jīng)元傳導(dǎo)速度明顯提高，并且伴隨著糖基化終末產(chǎn)物的減少，嚴重的節(jié)段性脫髓鞘改變減少，施萬細胞有所改善。葡萄多酚是否對糖尿病膀胱及尿道也有干預(yù)作用，目前缺乏相應(yīng)的研究。
　　第一部分 α1受體和NGF/ProNGF通路改變在糖尿病尿道功能障礙中作用的研究
　　目的:通過建立

6、大鼠糖尿病模型，研究糖尿病大鼠尿道中α1腎上腺能受體表達變化和NGF/ProNGF通路的改變，探討糖尿病大鼠尿道功能障礙的機制。
　　材料與方法:健康雌性SPF級Wistar大鼠，隨機分為實驗組、對照組兩組，STZ鏈脲佐菌素建立糖尿病模型。飼養(yǎng)八周后，對兩組大鼠進行膀胱尿道同步測壓;應(yīng)用α1受體阻滯劑后再次檢測尿道壓力變化。使用ELISA、RT-qPCR以及Western blot等方法檢測兩組大鼠尿道中α1受體(α1A、α1D)

7、、神經(jīng)生長因子(NGF)、ProNGF、P75受體、Sortilin表達情況。
　　結(jié)果:實驗組STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠八周后平均空腹血糖為445.72±28.58mg/dL，對照組大鼠空腹血糖96.84±18.25mg/dL，顯著性升高(P＜0.001)，確認糖尿病大鼠模型建立。觀察到糖尿病大鼠多食多飲多尿體重減輕，膀胱尿道重量高于對照組大鼠。膀胱尿道同步測壓結(jié)果，糖尿病組膀胱收縮壓明顯低于正常對照組，尿道壓高于對照組，應(yīng)用坦索羅辛

8、治療后，尿道壓力基線和尿道壓力最低值均降低。
　　α1a和α1d mRNA水平在糖尿病大鼠尿道中表達升高。糖尿病大鼠尿道中α1a和α1d蛋白水平升高。NGF mRNA水平在糖尿病大鼠尿道中表達顯著性降低(P＜0.05);NGF蛋白水平也觀察到在糖尿病大鼠尿道中表達顯著性降低(P＜0.05)。proNGF蛋白水平在糖尿病大鼠尿道中表達升高。P75NTR mRNA在糖尿病組中表達顯著性降低(P＜0.05)。P75NTR蛋白在糖尿病組中

9、表達顯著性降低(P＜0.05)，Sortilin表達沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:在糖尿病大鼠尿道α1受體表達較對照顯著增加，這可能是導(dǎo)致糖尿病鼠尿道壓力增加的直接原因。NGF在糖尿病尿道中表達下降，proNGF表達增加。NGF/ProNGF通路改變可能是導(dǎo)致糖尿病尿道功能障礙的發(fā)生的原因。推測在糖尿病大鼠NGF/proNGF信號通路的改變引起的交感神經(jīng)的損傷，從而上調(diào)尿道中α受體的表達，進而導(dǎo)致糖尿病鼠尿道壓力增加

10、。
　　第二部分 糖尿病膀胱中大麻素受體的研究
　　目的:研究糖尿病大鼠膀胱中大麻素受體1和大麻素受體2（CB1和CB2）的表達改變。探究大麻素受體激動劑和抑制劑對于糖尿病大鼠膀胱平滑肌肌條收縮功能的影響。
　　材料與方法:建立糖尿病大鼠模型，將八周糖尿病組大鼠和正常對照組處死，取膀胱和背根神經(jīng)節(jié)。用qRT-PCR和Western blot的方法分別從mRNA和蛋白水平檢測膀胱和背根神經(jīng)節(jié)中CB1和CB2的表達情況。用

11、混合性的CB1/CB2激動劑R(+)-WIN55,212-2(WIN)、選擇性CB1拮抗劑(AM251)以及CB2拮抗劑(AM630)分別處理糖尿病組和正常對照組大鼠膀胱平滑肌肌條。AM251和AM630預(yù)處理的膀胱肌條加用WIN后，觀察肌條收縮變化。
　　結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示大鼠膀胱組織中，糖尿病大鼠組中CB1和CB2蛋白水平較正常對照組顯著降低(P＜0.05)。背根神經(jīng)節(jié)中，糖尿病組CB1表達顯著降低(P＜0

12、.05)，CB2表達沒有顯著性差異。提示CB1在糖尿病大鼠膀胱中和背根神經(jīng)節(jié)中的表達都顯著性降低，CB2在膀胱中的表達顯著性降低，在背根神經(jīng)節(jié)表達無顯著性差異。
　　qRT-PCR結(jié)果大鼠膀胱中，糖尿病大鼠組中CB1和CB2蛋白水平較正常對照組顯著降低(P＜0.001)。背根神經(jīng)節(jié)中，糖尿病組CB1表達顯著降低(P＜0.01)，CB2沒有顯著性差異(P=0.22)。CB1在糖尿病大鼠膀胱中和背根神經(jīng)節(jié)中的表達都降低，CB2在膀胱中

13、的表達降低，在背根神經(jīng)節(jié)表達沒有變化。
　　膀胱離體逼尿肌肌條實驗證實糖尿病膀胱逼尿肌肌條的收縮幅度和收縮頻率較正常膀胱逼尿肌肌條組顯著降低(P＜0.05)。WIN以濃度依賴的方式抑制對照組及糖尿病組膀胱肌條的收縮幅度。隨WIN濃度的增加膀胱逼尿肌肌條收縮的頻率增加。溶劑對各組膀胱逼尿肌收縮無影響。此外，WIN對收縮幅度的影響在糖尿病不顯著(P＜0.05)。WIN對膀胱離體逼尿肌收縮幅度的影響可以被AM251部分阻斷，AM630對

14、其無明顯影響。
　　結(jié)論:CB1和CB2在大鼠膀胱組織和背神經(jīng)根中的存在，CB1在糖尿病大鼠膀胱中和背根神經(jīng)節(jié)中的表達都顯著性降低，CB2在膀胱組織中的表達顯著性降低，在背根神經(jīng)節(jié)表達無顯著性差異，提示CB1和CB2在糖尿病膀胱病變中可能發(fā)揮一定作用。CB1、CB2表達改變可能導(dǎo)致膀胱傳入神經(jīng)的損傷，引起糖尿病膀胱功能障礙。
　　第三部分 葡萄多酚對糖尿病膀胱尿道保護作用及分子機制的研究
　　目的:探究葡萄多酚對糖尿病

15、膀胱功能是否具有保護作用，并解析葡萄多酚(GSPE)的作用機制。
　　材料與方法:30只雌性wistar大鼠隨機分為三組（對照組、STZ誘導(dǎo)8周糖尿病組、GSPE灌胃糖尿病組）;運用膀胱尿道同步測壓的方法測定三組大鼠膀胱和尿道壓力;測定三組大鼠膀胱中SOD和GSH-Px活性以及MDA含量;檢測大鼠膀胱中Nrf2和HO-1蛋白水平的表達情況;制作大鼠膀胱切片，Tunel法測定膀胱組織中細胞凋亡情況，同時檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl2和Ba

16、x蛋白水平的表達情況;檢測神經(jīng)生長因子NGF以及proNGF在大鼠膀胱尿道的表達。
　　結(jié)果:尿流動力學(xué)檢查的結(jié)果顯示，GSPE治療組糖尿病大鼠膀胱最大收縮力較糖尿病組明顯好轉(zhuǎn)(P＜0.05)。大鼠膀胱HE染色結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠膀胱粘膜結(jié)構(gòu)異常，炎細胞浸潤，固有膜充血明顯，同時逼尿肌肌束排列紊亂;GSPE治療后，大鼠膀胱粘膜炎癥減輕，逼尿肌排列整齊。糖尿病大鼠膀胱較正常對照組相比，GSH-PX、SOD活性顯著降低，MDA含量顯

17、著升高(P＜0.05);GSPE治療后糖尿病大鼠膀胱氧化應(yīng)激狀態(tài)明顯改善，GSH-PX、SOD活性顯著升高，MDA含量降低(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)法以及Western blot結(jié)果都表明，GSPE治療后，糖尿病大鼠膀胱中Nrf2表達顯著升高，Nrf2下游分子HO-1的表達也增加(P＜0.05)。TUNEL細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠膀胱細胞較正常對照組凋亡增多，GSPE治療后，可減少糖尿病大鼠膀胱中細胞凋亡水平(P＜0.05

18、)。細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2在糖尿病組膀胱表達顯著降低，GSPE治療后表達升高;Bax在糖尿病組膀胱表達顯著升高，經(jīng)GSPE治療后表達降低。GSPE治療組大鼠膀胱和尿道中NGF表達量升高，proNGF表達降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:GSPE可以顯著改善糖尿病膀胱收縮功能，這一作用可能是通過激活Nrf2通路，降低膀胱細胞凋亡，促進NGF表達，改善膀胱神經(jīng)功能實現(xiàn)的。同時，葡萄多酚可以通過NGF/ProNGF通路改善糖尿病大鼠