GIGYF2在糖尿病腦病小鼠認知功能障礙中的作用機制研究.pdf

1、背景：
　　糖尿病長期糖代謝紊亂可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，導致認知功能障礙，腦信號傳導異常，神經(jīng)傳遞及突觸可塑性減弱等病理損害，統(tǒng)稱為糖尿病腦病。目前其發(fā)病機制尚不完全明確，缺乏有效的防治手段。近年來多項證據(jù)表明，胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)信號通路障礙與糖尿病的認知功能障礙發(fā)病密切相關。研究表明，生長因子受體結合蛋白10(Grb10)可負性調節(jié)IGF1R通路，持續(xù)高血糖可導致糖尿病大鼠海馬組織中Grb10的過表達，繼而導致

2、大鼠認知功能障礙等行為學改變。Grb10 GYF相互作用蛋白2(Grb10 Interacting GYFProtein2,GIGYF2)作為與Grb10分子N末端特異性結合的蛋白，兩者存在一定的協(xié)同作用。已有研究證實，GIGYF2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用，且GIGYF2表達水平的變化可影響IGF1R運輸，并激活IGF1引起的信號級聯(lián)反應。目前國內外對GIGYF2的研究多集中在基因水平，并證實其基因突變與家族遺傳性帕金森病的發(fā)病相

3、關。然而，內源性GIGYF2在糖尿病腦病中研究鮮有報道。
　　目的：
　　本研究旨在觀察GIGYF2基因在糖尿病腦病小鼠海馬組織中的表達，及其行為學和海馬組織病理學及超微結構的改變;并觀察特異性下調海馬組織GIGYF2基因表達，對Grb10和IGF1R基因表達的影響，對糖尿病腦病小鼠行為學和組織病理及超微結構的影響，從而探討內源性GIGYF2在糖尿病腦病中的主要作用及其機制。
　　方法：
　　糖尿病小鼠模型由單次

4、腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)（溶于0.1M檸檬酸鈉溶液PH4.5，180mg/Kg）誘導建立。72小時后取鼠尾靜脈血檢測空腹血糖，將血糖值達到或超過16.7mol/L者確定為糖尿病小鼠，血糖值未達標者予以剔除。以機體長期高血糖狀態(tài)，誘發(fā)糖尿病小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥。為進一步研究GIGYF2的功能，在糖尿病小鼠血糖穩(wěn)定后，我們通過立體定位技術將攜帶GIGYF2-shRNA的慢病毒顆粒定點注射入海馬組織，早期組織特異性的干預GIGYF2基

5、因的表達。糖尿病小鼠隨機分為三組:糖尿病(DM)組，糖尿病假干預(DM+0)組和糖尿病干預（DM+ shRNA）組，正常小鼠隨機分為對照(Con)組和正常干預(Con+ shRNA)組，每組12只小鼠。高血糖持續(xù)十周后，我們行水迷宮實驗評估小鼠的認知功能，經(jīng)實時熒光定量PCR和免疫印跡實驗測定各組小鼠GIGYF2，Grb10和IGF1R的表達水平，并通過光鏡和電鏡觀察海馬組織病理學及超微結構的變化。
　　結果：
　　1.腹腔

6、注射STZ誘導小鼠血糖水平明顯升高(P＜0.05)，而體重明顯低于正常對照組(P＜0.05)，成功建立糖尿病小鼠模型。
　　2.高血糖持續(xù)十周后行水迷宮實驗，結果顯示糖尿病腦病小鼠逃避潛伏期明顯延長(P＜0.01)，穿越站臺次數(shù)和目的象限內時間的明顯減少(P＜0.01)，小鼠學習和記憶功能受損，誘發(fā)認知功能障礙，形成糖尿病腦病;敲低糖尿病小鼠海馬組織GIGYF2的表達后，小鼠的逃避潛伏期、穿越站臺次數(shù)和目的象限內時間的變化不明顯，

7、與正常對照組的結果類似，而與糖尿病組相比均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，
　　3.糖尿病腦病小鼠海馬組織中GIGYF2和Grb10基因均較正常對照組明顯升高（P＜0.05或＜0.01），呈過表達，而IGF1R的表達水平卻明顯降低(P＜0.05)，且海馬組織中GIGYF2的表達水平與糖尿病腦病小鼠的認知功能水平相關。腦內定點注射GIGYF2-shRNA慢病毒顆?？砷L期穩(wěn)定下調糖尿病腦病小鼠海馬區(qū)GIGYF2基因的表達(P＜0.05

8、)，而對糖尿病小鼠Grb10的過表達和IGF1R的低表達無明顯影響，但IGF1R磷酸化水平明顯升高，恢復至正常水平(P＜0.05);
　　4.持續(xù)高血糖可導致糖尿病腦病小鼠海馬組織一系列病理生理變化:病理HE染色結果顯示，糖尿病小鼠海馬椎體細胞層排列紊亂，神經(jīng)元凋亡明顯，神經(jīng)膠質大量增生;海馬CA1區(qū)電鏡結果顯示，海馬神經(jīng)元腫脹，突觸小體的形態(tài)異常，突觸小體明顯減少。而海馬內敲低糖尿病小鼠海馬組織GIGYF2的表達，可明顯減少糖尿

9、病小鼠海馬組織神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)纖維纏結，減輕突觸小體形態(tài)和數(shù)量等超微結構的改變，保持良好的突觸功能，與正常小鼠海馬組織結構類似。
　　結論：
　　1.腹腔注射STZ可成功建立糖尿病小鼠模型，長期高血糖可導致小鼠行為學改變，誘發(fā)認知功能障礙，形成糖尿病腦病。
　　2.持續(xù)高血糖狀態(tài)可造成海馬組織GIGYF2的過表達和小鼠認知功能障礙。腦內定點注射GIGYF2-shRNA慢病毒顆?？砷L期穩(wěn)定下調海馬區(qū)該基因的表達水平，改

10、善糖尿病小鼠的認知功能障礙，表明糖尿病腦病小鼠的認知功能水平與海馬組織中GIGYF2的表達水平呈負相關。
　　3.糖尿病小鼠海馬組織GIGYF2表達接近正常水平時，對糖尿病腦病小鼠Grb10的過表達和IGF1R的低表達未產(chǎn)生明顯影響，而IGF1R磷酸化則恢復至正常水平，由此可活化IGF1R-Grb10信號通路。
　　4.糖尿病腦病小鼠海馬組織病理學和超微結構可有明顯的神經(jīng)元退行性變的表現(xiàn)，為小鼠認知功能障礙提供了組織學證據(jù)。

11、敲低糖尿病小鼠海馬組織GIGYF2的表達，可明顯改善海馬組織病理學和超微結構的改變。
　　綜上所述，糖尿病腦病中，內源性過表達的GIGYF2可通過綁定于Grb10分子的N末端與IGF1R間接結合，引起IGF1R磷酸化水平的變化，負性調節(jié)IGF1R及其下游信號通路，從而加劇糖尿病腦病的認知功能障礙。敲低糖尿病腦病小鼠海馬組織GIGYF2表達可明顯改善糖尿病引起的認知功能障礙以及海馬組織病理學和超微結構的變化，表明海馬內敲低糖尿病小鼠